RGD肽聚乳酸微球的制備

劉 莉,齊 濱

(長春中醫(yī)藥大學 藥學院,吉林 長春 130117)

RGD肽聚乳酸微球的制備

劉 莉,齊 濱

(長春中醫(yī)藥大學 藥學院,吉林 長春 130117)

目的 制備 RGD肽聚乳酸 (RGD-PLA)微球,并初步研究其性質(zhì)。方法 采用溶劑揮發(fā)法制備 RGDPLA微球,以包封率為考察目標,采用正交設計優(yōu)化制備工藝,并初步考察了其性質(zhì)。結(jié)果 優(yōu)化工藝后制備的RGD-PLA微球,形態(tài)均勻,粒徑范圍在 10～32μm,包封率在 74%以上。結(jié)論 所得 RGD-PLA微球,包封率高,穩(wěn)定性良好,有一定的緩釋效果。

RGD聚乳酸微球;溶劑揮發(fā)法;包封率

RGD肽是由精氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸三個氨基酸組成的具有生物活性的短肽序列,是細胞外基質(zhì)及血液中的許多黏附蛋白共有的細胞識別位點[1-2]。RGD肽在腫瘤診斷與治療領(lǐng)域具有很好應用前景[3]。但是 RGD活性肽在體內(nèi)易發(fā)生水解,清除速度快,影響其治療效果和生物活性[4]。

將 RGD制成微球劑型可以達到緩釋、靶向給藥的目的,降低給藥量,同時減少藥物的毒副作用[5]。聚乳酸(PLA)是一種重要的脂肪族聚酯類生物降解材料,無毒、無刺激,具有良好的生物相容性,被廣泛用于組織工程、人體器官、藥物控制釋放、仿生智能等[6]。本文制備了 RGD-PLA微球,優(yōu)化制備工藝,并初步考察其性質(zhì)。

1 材 料

RGD(吉林大學酶工程實驗室提供,純度75%);PLA(山東省醫(yī)療器械研究所高分子室,平均相對分子質(zhì)量 20 000);明膠 (山東益心生物科技有限公司,化學純);二氯甲烷,乙醇均為分析純。

UVm ini-1240紫外可見分光光度計 (日本島津);KQ-2200E超聲波清洗器 (上海精密儀器儀表有限公司);37XB倒置生物顯微鏡 (上海光學儀器廠)。

2 方 法

2.1 RGD含量測定

2.1.1 測定波長的選擇 配制 0.25m g/mL RGD溶液,在 190～500 nm波長掃描,最大吸收波長為200 nm,因此選擇在該波長進行測定。

2.1.2 標準曲線 配置濃度為 0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5m g/mL的 RGD系列溶液,分別測定在200 nm波長的吸光度 (A)值,將濃度 (C)對 A進行線性回歸,得標準曲線方程:A =1.863 C+0.011,r=0.999 5。

2.2 制備工藝

RGD-PLA微球的制備采用溶劑揮發(fā)法。將PLA溶解于二氯甲烷中,加入 RGD,完全溶解后,超聲,制成有機相。將該溶液加入明膠溶液中,不斷攪拌使二氯甲烷完全揮發(fā),靜置,離心,洗滌。減壓干燥得白色粉末狀固體微球[7-8]。

2.3 正交試驗設計

通過預試驗,選取溫度為 25℃(恒溫空氣浴),轉(zhuǎn)速為 1 000 r/m in。在溫度和攪拌速度一定的條件下,根據(jù)文獻 [7-8],RGD和 PLA的用量 RGD/PLA(A)、油水相比 (B)、明膠溶液的百分比 (C)和乳化時間 (D)等四個因素對微球的包封率有很大影響。所以選擇這四個因素,在預試驗的基礎(chǔ)上,以包封率為指標進行評價,設計了 4因素 3水平正交實驗,通過L9(3)4正交試驗設計優(yōu)選微球最佳制備工藝條件,因素水平表見表 1。

表 1 正交實驗因子水平Tab.1 Facto r-level in orthogonal-designing experim ents

2.4 包封率測定

精密稱取 RGD-PLA微球適量,溶于二氯甲烷,然后加入水,用 0.1mo l/L HC l溶液萃取,離心取上清液。在 200 nm波長處測定A值,并由標準曲線求出 RGD的濃度,并計算包封率。包封率 =(微球中 RGD的含量 /所投 RGD的量)×100%。

2.5 形態(tài)和粒徑分布的觀察

倒置生物顯微鏡下觀察微球的外觀形態(tài),同時計算微球的平均粒徑、粒度分布。

2.6 體外釋藥性能的考察

精密稱取 RGD-PLA微球 30 m g,用 pH 7.4磷酸鹽緩沖液 5mL溶解后裝入透析袋內(nèi),置于裝有pH 7.4磷酸鹽緩沖液 90 mL的燒杯中,密封。37℃,150 r/m in恒溫震蕩。定時取樣 5mL,并補充磷酸鹽緩沖液 5mL。測定含量,并計算釋放度。

3 結(jié)果與討論

3.1 微球制備工藝的優(yōu)選

正交試驗結(jié)果見表 2。從正交結(jié)果分析可得,影響因素 A>B>D>C,所得最佳工藝條件為:A2B2C3D3。根據(jù)最佳工藝條件制備 RGD-PLA微球3批,測得包封率為分別為 74.8%,75.5%和74.1%,與預期基本一致。與陳志奎等[9]制備的眼鏡蛇毒細胞毒素 PLA/PLGA緩釋微球、武繼民等[10]制備的堿性成纖維細胞生長因子 PLGA緩釋微球的包封率相近。

表 2 正交實驗結(jié)果及其統(tǒng)計學處理Tab.2 Results and analysis of o rthogonal-designing experim ents

3.2 微球形態(tài)和粒徑分布

RGD微球的外觀為白色疏松粉末,在水中分散性良好。在倒置顯微鏡下觀察,RGD微球的形態(tài)圓整,表面光滑,分布均勻,粒徑在 10～32μm,占總數(shù)的 85%以上 (圖 1)。

圖 1 RGD-PLA的形態(tài)Fig.1 Form sof RGD-PLA

3.3 體外釋藥性能的考察

RGD-PLA微球在的累積釋放曲線見圖 2。由圖2可以看出,在 120 h以內(nèi)累積釋藥 60%,緩釋效果良好。

4 結(jié) 論

圖 2 RGD-PLA的藥物釋放曲線Fig.2 D rug-releasing curves for RGD-PLA

本文通過正交試驗優(yōu)化了RGD-PLA微球的制備工藝,得到的最佳工藝條件為:RGD和 PLA之比為為 2∶5,油相與水相的體積比為 1∶5,明膠溶液的比例為 1%,乳化時間為 7 h。在此條件制造備的RGD-PLA微球包封率在 74%以上。所得的微球形態(tài)圓滑,分布均勻,體外釋放試驗表明,該微球緩釋效果良好。

[1] 劉儉.RGD肽與腫瘤治療研究進展[J].國外醫(yī)學:腫瘤學分冊,2003,30:193-197.

[2] 肖斌.RGD肽在腫瘤治療中的研究進展[J].中國腫瘤臨床,2005,32(19):33-34.

[3] 安蓮效,李慧,顧月清.RGD肽作為藥物靶向配體的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2010,31(1):66-69.

[4] 楊大志,郝杰.多肽對生物材料表面修飾的研究現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)學:生物醫(yī)學工程分冊,2004,27:65-68.

[5] 李長文,鄭啟新,郭曉東,等.RGD多肽修飾的改性 PLGA仿生支架材料對骨髓間充質(zhì)干細胞粘附性影響的研究[J].中國生物醫(yī)學工程學報,2006,25(2):142-147.

[6] 楊小玲,王珊,段遠福.聚乳酸基生物降解性高分子材料在醫(yī)用領(lǐng)域的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2010,31(1):59-62.

[7] 王哲,倪宏哲,張明耀,等.聚乳酸微球制備工藝的研究[J].高分子材料科學與工程,2007,23(6):207-210.

[8] 馮曉健,王偉,趙敏.聚乳酸頭孢唑啉鈉微球的制備及其釋藥性能[J].南京師范大學學報,2008,31(3):76-80.

[9] 陳志奎,林禮務,林琦,等.眼鏡蛇毒細胞毒素緩釋微球制備及體外性質(zhì)研究[J].中國生化藥物雜志,2008,29(3):161-163.

[10]武繼民,汪鵬飛,李志宏,等.bFGF-PLGA緩釋微球及其體外釋藥性能研究[J].中國生化藥物雜志,2010,31(1):32-34.

Prepara tion ofm icrosphere con ta in ing RGD w ith po ly lactic ac id

L IU L i,Q IB in
(School of Pharm acy,Changchun University of TCM,Changchun 130117,China)

Purpose To study the p reparation and characteristic of RGD polylactic acidm icrosphere.M ethods The solution-evaporationm ethodswere used to p repare RGD-PLA m icrosphere,considering the envelopm ent rate as inspection tatgetand op tim izing by orthogonaldesign.W e studied the characteristic of RGD-PLA m icrosphere.Resu lts The p reparedm icrosphereswere nice and uniform,the partic le diam eterwasbetween 10-32μm,and the best envelopm ent ratewas75.54%.Conclusion The RGD-PLA m icrosphere had a high envelopm ent rate and stability,and had certain slow-release effect.

RGD-PLA;so lution-evaporation;envelopm ent rate

R944.9

:A

:1005-1678(2010)06-0407-03

2010-04-18

劉莉,女,博士研究生,講師,主要從事中藥學和化學藥物研究工作,Tel:0431-86172203,E-mail:qibin88@126.com。