大孔樹脂純化金褐霉素的研究

孟憲軍,王 瓊,＊,魏 杰

(1.沈陽農業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110161;2.遼寧大學生命科學院,遼寧沈陽 110036)

大孔樹脂純化金褐霉素的研究

孟憲軍1,王 瓊1,＊,魏 杰2

(1.沈陽農業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110161;2.遼寧大學生命科學院,遼寧沈陽 110036)

通過比較八種大孔樹脂對金褐霉素發(fā)酵液的吸附和解吸效果,從中篩選出適合金褐霉素分離純化的樹脂,并對其吸附和解吸性能進行研究。結果表明,X-5樹脂最適合金褐霉素的純化,洗脫劑甲醇的體積分數(shù)為 80%,上樣液pH5.0,洗脫液 pH7.0,吸附流速為 1.0BV/h,洗脫流速為1mL/min,此方法所得金褐霉素純度較高,且有明顯的脫色效果。

大孔吸附樹脂,金褐霉素,純化,HPLC法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金褐霉素提取液 本實驗室自制;甲醇 分析純,沈陽化學試劑廠;X-5大孔吸附樹脂 天津南開大學化工廠;HPD100、HPD400、HPD600、HPD200A、AB-8大孔吸附樹脂 滄州寶恩化工有限公司;D101大孔吸附樹脂 上海邁坤化工有限公司;WD-6大孔陰樹脂 安徽皖東化工有限公司。

SBA-100數(shù)控計滴自動部分收集器、HL-2S恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;玻璃層析柱 Ф1cm× 30cm 華美實驗儀器廠;RE-52型旋轉蒸發(fā)儀 上海博通經貿有限公司;SH2-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;高效液相色譜儀 美國Waters;FA1104電子天平 上海天平儀器廠; pHS-25型酸度計 上海理達儀器廠;DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液預處理 取發(fā)酵液加入離心管,充分振蕩后高速離心 (10000r/min,10min)所得上清液即為待測液。

1.2.2 樹脂預處理 樹脂采用常規(guī)方法進行預處理,預處理流程如下：以 0.5BV(1BV為 1個樹脂床體積)的乙醇浸泡樹脂 24h;用 2BV乙醇以 2BV/h的流速通過樹脂柱,并浸泡樹脂 4～5h;用乙醇 2BV/h的流速洗滌樹脂,至流出液加水不呈白色混濁為止,再用水以同樣流速洗凈乙醇;用 2BV的 5%HCl溶液以4～6BV/h的流速通過樹脂層,并浸泡樹脂 2～4h,而后用水以同樣流速洗至出水 pH呈中性;用 2BV的2%NaOH溶液以 4～6BV/h的流速通過樹脂層,并浸泡樹脂 2～4h,而后用水以同樣流速洗至出水 pH呈中性[8]。

1.2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附率及解析率測定 準確稱取已預處理的大孔樹脂 1.00g,置于 100mL具塞三角瓶中,加入 20mL金褐霉素提取液,置于室溫振蕩吸附 24h后,測定金褐霉素提取液的濃度。用蒸餾水洗去溶液中殘余金褐霉素后吸干水分,然后用甲醇洗脫樹脂,分別測定洗脫液中金褐霉素的濃度,計算各樹脂的吸附率及解析率。

吸附率Q(%)=(C0-C1)×100%/C0

式中：Q-吸附率(%);C0-吸附前濃度,mg/mL; C1-吸附后濃度,mg/mL。

解吸率D(%)=C2×100%/(C0-C1)

式中：D-解吸率(%);C0-吸附前濃度,mg/mL; C1-吸附后濃度,mg/mL;C2-解吸后濃度,mg/mL。

1.2.4 上樣液最適 pH的選擇 將金褐霉素提取液用NaOH或 HCl溶液調至不同的 pH,上柱,依次用200mL同樣 pH的蒸餾水及甲醇進行洗脫,收集甲醇洗脫液,測定金褐霉素的濃度,確定其最佳 pH。

1.2.5 洗脫液最適 pH的選擇 取一定量的金褐霉素提取液上柱,先用蒸餾水洗脫至無色后,依次用200mL不同 pH的甲醇進行洗脫,收集不同 pH的甲醇洗脫液,測定其金褐霉素的濃度,以確定最佳的洗脫劑pH。

1.2.6 洗脫劑濃度的選擇 取一定量的金褐霉素提取液上柱,先用蒸餾水洗脫至無色后,依次用 200mL 20%～100%濃度的甲醇溶液進行洗脫,收集不同濃度的甲醇洗脫液,測定金褐霉素的濃度,以確定最佳的洗脫劑濃度。

1.2.7 大孔樹脂動態(tài)吸附與解析實驗 樹脂濕法裝柱(1.0cm×30.0cm),分別以 0.5、1.0、1.5BV/h的流速加入一定體積濃度的金褐霉素的供試液,待樣品溶液全部通過樹脂柱后,分步收集流出液 (每管25mL),定時檢測流出液中金褐霉素的濃度,當達到泄漏濃度時,視為吸附完全,確定最佳吸附流速。

取一定體積濃度的金褐霉素供試液上柱,待吸附飽和后,用 2BV的蒸餾水洗滌后,再用甲醇分別以0.5、1.0、1.5mL/min的流速進行洗脫,分段收集洗脫液(每管 25mL),測其金褐霉素含量,確定其最佳洗脫流速。

1.2.8 金褐霉素測定 采用高效液相色譜法測定[9]。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂對金褐霉素的靜態(tài)吸附與解析效果比較

物質在溶劑中的溶解度大,樹脂對此物質的吸附力就小,反之就大。吸附實驗前將金褐霉素提取液進行減壓濃縮,在溫度 25℃,轉速 100r/min的條件下進行吸附和解吸,再用 100%甲醇進行洗脫,吸附和解吸時間均為 24h,8種大孔吸附樹脂篩選結果顯示如表1。

表 1 大孔樹脂對金褐霉素的靜態(tài)吸附與解析性能

從表 1中可以看出,HPD400,X-5,WD-6,AB-8四種樹脂的吸附率較高,均可達到 70%以上,X-5達78.7%。在生產上不僅要求樹脂吸附率大,還要求解吸率高,以保證有效成分最大限度回收。因此,解吸率也是樹脂實驗考察的重要指標。由表 1可知, HPD100樹脂和X-5樹脂的解吸率較好,綜合吸附率和解吸率兩個指標,因而選定 X-5型樹脂作為較適宜的填料進行后續(xù)實驗研究。

2.2 上樣液 pH對 X-5樹脂吸附性能的影響

在溶液介質中,金褐霉素的結構會隨 pH的降低或升高而發(fā)生降解。金褐霉素在 pH4～8的范圍內較穩(wěn)定,因此,將 pH的考察范圍設定為 4、5、6、7、8進行實驗。由圖 1可知,上樣液 pH為 5時,樹脂對金褐霉素的吸附率最高,上樣液 pH為 8時次之。而發(fā)酵達到終點時的發(fā)酵液 pH在 5～6.5范圍內,因此,可稍微調整或不用調整發(fā)酵液的 pH直接進行吸附。

圖 1 上樣液pH對樹脂吸附金褐霉素的影響

2.3 洗脫液 pH對解吸的影響

洗脫液的 pH對金褐霉素的洗脫能力有影響。通過改變洗脫液的 pH,可使吸附物形成較強的離子化合物,很容易被洗脫下來,從而提高洗脫率。

圖 2的實驗結果表明,隨著 pH逐漸升高,解吸率逐漸升高,在 pH為 7時,X-5樹脂對金褐霉素的解吸效果最好,且有明顯的脫色效果。但當 pH為 8時,解吸率陡然下降,說明洗脫液的 pH對解吸率的影響很大。

圖 2 洗脫液pH對樹脂解吸金褐霉素的影響

2.4 洗脫劑濃度的確定

將已吸附金褐霉素飽和的 X-5樹脂等分成 9份,分別用不同濃度的甲醇溶液作為解析劑,測定解析液的金褐霉素含量,計算解析率。圖 3的實驗結果表明,隨著甲醇濃度的逐漸升高,解吸率逐漸升高,在甲醇濃度達到 100%時,解吸率達到最高。甲醇濃度在 80%～100%之間,解吸率相差不是很大?？紤]到節(jié)約成本,可以選用 80%甲醇作為洗脫劑。

圖 3 洗脫劑濃度對樹脂解吸金褐霉素的影響

2.5 上樣液流速對樹脂吸附的影響

流出液中的目的產物濃度達到進口濃度的 10%時,即為吸附終點。達到吸附終點時上樣液的體積值就是泄露點。從圖 4可以看出,流速越大,層析柱的泄漏點越提前,X-5樹脂的吸附效果隨著流速的增加而降低。這是因為大孔吸附樹脂的柱層析是多分子層吸附,是一種動態(tài)吸附過程。流速對吸附的影響主要是影響溶質向樹脂內表面擴散,從而影響了吸附效率。流速過快,接觸時間短,金褐霉素還沒來得及與樹脂內表面接觸就流出吸附柱,極大降低吸附效果。雖然低流速對吸附有利,但流速過低,操作時間長,效率較低。當流速為 0.5BV/h和 1.0BV/h時的泄露點出現(xiàn)的時間接近,所以從提高效率考慮,選擇 1.0BV/h為最佳上柱流速。

圖 4 吸附流速對金褐霉素吸附效果的影響

2.6 洗脫流速的確定

一般情況下,洗脫流速過大,洗脫溶劑還沒來得及交換和溶解大孔吸附樹脂上被吸附的有效成分,就從柱中流出,從而沒有達到分離純化的目的,而且也極其耗費溶劑;但洗脫流速過小,洗脫時間就會增加。在實際應用中,應綜合考慮,選用合適洗脫流速,既要使大孔吸附樹脂的洗脫效果好,又要保證較高的工作效率[10]。實驗用甲醇溶劑以不同的洗脫流速對飽和吸附的樹脂進行洗脫,分析結果見圖 5。

圖 5 洗脫流速對金褐霉素洗脫效果的影響

從圖 5中可以看出,流速對洗脫效果有明顯影響,流速越高,洗脫時脫尾現(xiàn)象越明顯,所需洗脫劑也就越多。以 0.5mL/min和 1.0mL/min流速洗脫金褐霉素,峰形陡峭,峰值較高,綜合考慮實驗效率,控制洗脫流速在 1.0mL/min為佳,此時既能達到滿意效果,又能提高洗脫效率。

3 結論

金褐霉素可以通過用大孔吸附樹脂進行分離純化。通過對八種樹脂吸附性能對比篩選,認為 X-5樹脂最適合金褐霉素的純化。實驗結果表明,洗脫劑體積分數(shù)為 80%,上樣液 pH5.0,洗脫液 pH7.0,吸附流速為 1.0BV/h,洗脫流速為 1mL/min時,此方法所得金褐霉素純度較高,且有明顯的脫色效果。

[1]上海藥物研究所金褐霉素研究小組 .一種新的抗真菌的抗生素——金褐霉素[J].微生物學報,1975,15(3)：180-187.

[2]周亦昌,龔炳永 .金褐霉素化學結構的研究[R].論文摘要匯編,1989：20.

[3]Basilico J C,Debasilico M Z,Chlericattic,etal. Characterization and contron of thread mould in cheese[J].Lett ApplMicrobiol,2001,32(6)：419-423.

[4]王富金,武濟民 .金褐霉素微生物檢定法 [J].抗生素, 1980,5(5)：25-26.

[5]范德彰,蔡松年 .金褐霉素治療真菌性角膜潰瘍——實驗研究及 248例臨床療效觀察[J].中華眼科雜志,1985,21(5)：257-259.

[6]Basilico J C,DebasilicoM Z,ChlericattiC,etal. Characterization and contron of thread mould in cheese[J].Lett ApplMicrobiol,2001,32(6)：419-423.

[7]高萍 .大孔樹脂在天然藥物分離純化中的應用[J].天津藥學,2006,18(2)：63-66.

[8]黎海彬,李琳,楊曉泉,等 .大孔吸附樹脂提取羅漢果皂甙的研究[J].食品工業(yè)科技,2003,24(2)：19-21.

[9]孟憲軍,魏杰,王瓊,等 .高效液相法測金褐霉素生物效價的研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(2)：299-301.

[10]劉偉,劉成梅,李明,等 .大孔吸附樹脂純化姜辣素研究[J].食品科學,2005,26(9)：226-228.

Study on the purification of aureofuscin by macroporous resin

M ENG Xian-jun1,WANG Qiong1,＊,W EI Jie2
(1.Food SciencesAcademy,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang 110161,China; 2.Life and SciencesAcademy,LiaoningUniversity,Shenyang 110036,China)

Through the comp a rison am ong the e ight typ es of m ac rop orous res in adsorp tion and desorp tion ra te of aureofusc in,the op tiona l m ac rop orous res in for aureofusc in was dec ided,and absorp tion and desorp tion cap ab ilities of aureofusc in we re s tud ied.The results showed tha t X-5res in was the bes t one for the p urifica tion of aureofusc in,w ith80%m e thanol as e luant.Samp le pH was5.0,and flowed pH was7.0.The m oving sp eed was 1.0BV/h and the e luting sp eed was1.0mL/m in.Then,highe r p roduc t p urity and c lea r effec t on decolored can be ob ta ined.

m ac rop orous res in;aureofusc in;p urifica tion;HPLC m e thod

TS201.1

B

1002-0306(2010)02-0277-03

金褐霉素 (Aureofuscin)是鏈霉菌新種—金褐鏈霉菌 (Streptomyces aureofuscus.n.sp)產生的一種四烯大環(huán)內酯類抗真菌抗生素,其化學結構與國外文獻報道的納他霉素(Natamycin)結構相似。早期研究表明,金褐霉素對霉菌、多種酵母菌及絲狀真菌有很強的抗菌作用,但不抗細菌,臨床上用于治療真菌性角膜炎,其療效優(yōu)于兩性霉素 B,同時對一些真菌引起的皮膚病及霉菌性陰道炎等也有很好療效。金褐霉素早在 1975年發(fā)現(xiàn)時只作了早期化學結構和初步藥效實驗后,一直未作深入研究和進行產業(yè)化開發(fā)[1-3]。迄今為止,國內真正擁有自主知識產權的四烯類抗生素只有金褐霉素。在 1997年我國正式批準使用納他霉素作為安全食品防腐劑后,金褐霉素才被重新重視起來,由于未作高產菌種選育和分離提取工藝的深入研究,發(fā)酵單位和提取收率都不高,難以達到產業(yè)化開發(fā)要求[4-6]。鑒于金褐霉素與納他霉素有著相似的化學結構和生物活性,而納他霉素現(xiàn)在主要依賴進口,因此,金褐霉素的研究開發(fā)在真菌疾病的防治和食品防腐上顯示出了極好的應用前景和市場潛力,這對促進新藥研制、食品防腐和發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展都具有積極意義。目前關于金褐霉素分離提取方面的研究鮮有報道。大孔吸附樹脂是近十年來發(fā)展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑,廣泛用于生物活性物質的分離提取[7]。本研究采用 8種不同類型大孔吸附樹脂對發(fā)酵液進行吸附和解吸,從中篩選出適合金褐霉素分離純化的樹脂,并對其吸附和解吸性能進行研究,優(yōu)化大孔樹脂分離純化金褐霉素的工藝,為金褐霉素的大規(guī)模生產奠定基礎。

2009-04-17 ＊通訊聯(lián)系人

孟憲軍(1960-),男,教授,沈陽農業(yè)大學食品學院院長,研究方向：食品制造與保藏。