原子力顯微鏡在牛肉嫩度測定中的應(yīng)用研究

李林強(qiáng),昝林森,孟 嫚

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

原子力顯微鏡在牛肉嫩度測定中的應(yīng)用研究

李林強(qiáng)1,2,昝林森1,＊,孟 嫚2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

【目的】探討原子力顯微鏡在牛肉嫩度測定中的應(yīng)用,為肉品嫩度提供可靠、直觀的測定方法?！痉椒ā坑?100、150、200mmol/L不同濃度氯化鈣(CaCl2)處理牛肉,肉樣真空包裝后于 4℃下成熟 72h后測定剪切力、肌原纖維指數(shù)(MFI),并用原子力顯微鏡觀察肌原纖維小片,比較三者結(jié)果?！窘Y(jié)果】三種測定方法結(jié)果基本一致,但有一定差異,原子力顯微鏡觀察肌原纖維小片直觀地反映了肌原纖維小片化程度?！窘Y(jié)論】原子力顯微鏡能直觀地反映肉的嫩化情況,是對剪切力和MFI測定方法在形態(tài)學(xué)上的完善。

原子力顯微鏡,牛肉嫩度,剪切力,肌原纖維小片化指數(shù)

Binning等 1981年利用量子力學(xué)隧道效應(yīng)研制出掃描隧道顯微鏡 (scanning tunnel microscope, ST M),隨后Binnig與斯坦福大學(xué)的 Quate和 I BM蘇黎士實(shí)驗(yàn)室的 Gerber1985年在 ST M基礎(chǔ)上改進(jìn)推出了原子力顯微鏡 (atomic force microscope,AF M)[1],兩者均具有納米級超高分辨率。但相對于 ST M和普通電鏡,AF M通過其粗細(xì)只有一個原子大小的探針在非常近的距離上探索物體表面的情況,便可以分辨出其他顯微鏡無法分辨的極小尺度上的表面細(xì)節(jié)與特征[2]。肉質(zhì)嫩度是禽肉食用品質(zhì)的一個重要感官特征,也是肉品質(zhì)量的重要指標(biāo)[3-4]。嫩度的客觀指標(biāo)是剪切力值,肌原纖維小片化指數(shù) (myofibril fragmentation index,MFI)也是衡量肉嫩度的重要指標(biāo)之一。由于剪切力在測定過程中很難保持肉塊厚度或肉柱直徑大小一致,可能導(dǎo)致測定誤差較大。19世紀(jì) 60年代研究發(fā)現(xiàn)肌肉的嫩度與肌原纖維的斷裂有關(guān)[5],提出了利用肌原纖維小片化指數(shù)(myofibril fragmentation index,MFI)來考察肉質(zhì)的嫩度[6],在 70年代才正式建立,相比其它嫩度測定技術(shù)而言,該方法建立的時間相對較晚,在有些方面還有待進(jìn)一步研究和完善[7]。原子力顯微鏡是一種更為突出的顯微觀察技術(shù),本文通過用不同濃度 CaCl2(100、150、200mmol/L)處理牛肉,測定剪切力和MFI,并用原子力顯微鏡觀察肌原纖維小片,比較三者結(jié)果,擬探討原子力顯微鏡在測定牛肉嫩度中的應(yīng)用,以期為肉品嫩度的測定提供更為準(zhǔn)確、可靠、直觀的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CaCl2、KCl、K3PO4、EDTA、HCl、牛血清白蛋白Roche公司;CuSO4·5H2O,NaKC4H4O6·4H2O, NaOH,KI。

C-LM型肌肉嫩度計 東北農(nóng)業(yè)大學(xué);紫外分光光度計 UV-754,上海;勻漿器 德國;冷凍離心機(jī)SCR20BC,日立;原子力顯微鏡 Atomic Force Microscopy,WET-SP M-9500J3,日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉樣采集與處理 2歲秦川公牛按照標(biāo)準(zhǔn)的屠宰工藝屠宰,胴體經(jīng)預(yù)冷 20h后,將左右兩側(cè)背最長肌取下(第 10胸椎到第 4腰椎),在每條背最長肌上從前往后依次分割 10塊厚 2.5cm肉塊,然后隨機(jī)分成 4組,每組 5塊,一組注射肉重 10%的蒸餾水。另外 3組分別注射肉重 10%的 100、150、200mmol/L CaCl2。將注射好的肉樣真空包裝后于 4℃下成熟 3d后測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 剪切力測定 將修整后 2.5cm厚的分割肉塊真空包裝于 85℃水浴加熱至中心溫度 80℃,取出冷卻至室溫并放入 4℃冷藏間過夜,然后用直徑 1.27cm的中空取樣器沿肌纖維方向取樣。每塊肉鉆取 5個肉柱,然后用肌肉嫩度計垂直肌纖維方向測定每個肉柱的剪切力值。同一肉塊所有的剪切力值的平均值即為該肉塊的剪切力值。

1.2.3 肌纖維提取和MFI測定 去除肉樣可視脂肪和結(jié)締組織,稱取約 5g,放入勻漿器,加入 10mL 2℃分離介質(zhì) (100mmol/L KCl、20mmol/L K3PO4、0.1mmol/L EDT A、1mmol/L CaCl2、溶液用 HCl調(diào)整pH為 7.0),高速低溫勻漿 1min。勻漿在 4℃低溫離心機(jī) 3000×g下離心 15min,然后緩慢倒出上層清液,沉淀中又加入 10mL、2℃分離介質(zhì),用攪捧制成懸液,重復(fù)上述離心步驟,倒出上層清液,加入 2.5mL分離介質(zhì)于漩渦混合器上混勻,通過 200目篩網(wǎng)濾去結(jié)締組織,再加 2.5mL分離介質(zhì)來幫助肌原纖維通過篩孔,混勻肌原纖維懸浮液。利用標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白配制成不同濃度的蛋白,分別為 0、2、4、6、8、10mg/L,利用雙縮脲法其 540nm處的吸光值,以吸光值為縱坐標(biāo),蛋白濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用MFI分離介質(zhì)調(diào)整懸浮液蛋白濃度為 0.5±0.05mg/mL,在 540nm測吸光度,將所得結(jié)果乘 200后便得到MFI值。

1.2.4 原子力顯微鏡對肌原纖維小片的測定 按照上述方法制備混勻肌原纖維懸浮液(蛋白濃度為 0.5 ±0.05mg/mL),調(diào)整懸液體積為 10mL,混勻,吸取1μL肌原纖維懸液滴于云母片上,自然風(fēng)干,直接進(jìn)行原子力顯微鏡觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 運(yùn)用 SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以±sD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度 Ca2+對牛肉剪切力的影響

由圖 1可知,隨著 Ca2+濃度的增加,肉樣剪切力呈下降趨勢,表明肉的嫩度增加。不同濃度 Ca2+對牛肉處理后其剪切力均極顯著下降 (Plt;0.01), 100mmol/L和 150mmol/L,150mmol/L和 200mmol/L Ca2+處理牛肉間剪切力下降差異均不顯著 (Pgt; 0.05)。表明 150mmol/L Ca2+對牛肉處理嫩化效果較為理想。

圖 1 不同濃度 Ca2+對牛肉剪切力的影響

2.2 不同濃度 Ca2+對牛肉MF I的影響

由圖 2可知,隨著 Ca2+濃度的增加,肉樣MFI呈上升趨勢,但 200mmol/L Ca2+處理肉樣的MFI下降,與圖 1嫩化結(jié)果不同。100、150mmol/L Ca2+處理肉樣的MFI增加顯著 (Plt;0.05),200mmol/L Ca2+處理肉樣的MFI相對 100、150mmol/L Ca2+處理肉樣的MFI下降顯著 (Plt;0.05),這與上文剪切力測定結(jié)果不同。表明 150mmol/L Ca2+對牛肉處理嫩化效果較為理想,與上文分析結(jié)果基本一致,但處理間結(jié)果比較的差異不同。

圖 2 不同濃度 Ca2+對牛肉MFI的影響

2.3 原子力顯微鏡對肌原纖維小片測定

由圖 3可知,對照肉樣肌原纖維呈網(wǎng)狀連接,分離小片極少;隨著 Ca2+濃度的增加,處理肉樣肌原纖維小片依次顯著增多。肌原纖維小片越多,表明肌原纖維降解越多,肉的嫩度越大,可知,100、150、200mmol/L Ca2+處理肉樣嫩度依次增大,這與剪切力測定結(jié)果相似,但與以MFI作為嫩化指標(biāo)有一定差異。又由圖 3可知,100mmol/L Ca2+處理肉樣肌原纖維直徑較大約為 2.5μm,150mmol/L Ca2+和200mmol/L Ca2+處理肉樣肌原纖維直徑約為 1μm,由于肌原纖維直徑是影響肉嫩度的主要因素之一[8-10],因此, 150mmol/L Ca2+和 200mmol/L Ca2+處理肉樣的嫩度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 100mmol/L Ca2+處理肉樣和對照嫩度,這與上文剪切力和MFI測定結(jié)果有一定的差異。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所采用的 3個濃度水平的 Ca2+處理,以剪切力、MFI作為嫩化指標(biāo),結(jié)果表明,牛肉嫩度改善顯著(Plt;0.05),與原子力顯微鏡觀察測定肌原纖維小片結(jié)果基本一致。但剪切力測定結(jié)果表明,150、 2 0 0 m m o l／LC a2+對牛肉處理間結(jié)果差異不顯著(Pgt; 0.05),MFI測定結(jié)果表明,150mmol/LCa2+比100mmol/L Ca2+處理牛肉嫩度顯著 (Plt;0.05),這與原子力顯微鏡測定測定肌原纖維小片結(jié)果有所不同。原子力顯微鏡測定結(jié)果表明,200、150、100mmol/L Ca2+處理肉樣嫩度依次增大,而且處理間結(jié)果差異顯著。剪切力一般通過剪切力儀或質(zhì)構(gòu)儀剪切測定獲得,是用中空取樣器沿肌纖維方向取樣,然后用剪切力儀或質(zhì)構(gòu)儀垂直肌纖維方向測定肉柱的剪切力值。由于肉樣易變形,即使是同一肉柱直徑大小也不一,導(dǎo)致測定誤差較大,影響處理間差異的比較。MFI測定是通過制備肌原纖維懸浮液,通過肌原纖維懸浮液的吸光值來表示嫩度,是一種間接測定肉嫩度的方法,由于肌原纖維小片的大小對吸光值的影響較大,另外,在制備肌原纖維懸浮液的過程中勻漿速度、勻漿時間均影響肌原纖維斷裂指數(shù)測定[11-12]。因此,剪切力和 MFI測定值并不能完全反映肉的嫩化情況。而原子力顯微鏡通過測定肌原纖維小片化指數(shù)及肌原纖維直徑較能準(zhǔn)確、直觀地反映肉的嫩化情況,是對MFI測定方法的改進(jìn)和完善,同時又克服了剪切力測定不能直接觀察的缺點(diǎn),因此,原子力顯微鏡是研究肉質(zhì)嫩度的有力工具,但其標(biāo)準(zhǔn)化操作還應(yīng)進(jìn)一步研究。

圖 3 不同濃度 Ca2+對肌原纖維小片化的影響

4 結(jié)論

原子力顯微鏡能直觀地反映肉的嫩化情況,是對剪切力和MFI測定方法在形態(tài)學(xué)上的完善,是研究牛肉嫩度有力的輔助工具。

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Study on application of atomic force microscopy in beef tendernessmeasurement

L IL in-qiang1,2,ZAN L in-sen1,＊,M ENGMan2
(1.College ofAnimal Science and Technology,Northwest Sci-Tech University ofAgriculture and Forestry,Yangling 712100,China;2.College of Food Engineering and Nutritional Science,ShaanxiNor malUniversity,Xi’an 710062,China)

【O b jec tive】App lica tion of a tom ic force m ic roscop y in beef tende rness m easurem ent was s tud ied to supp ly re liab le and intuitive m e thod for m ea t tende rness m easurem ent.【M e thod】Beef was tende riza tion trea ted w ith100,150and200mm ol/L ca lc ium chloride(CaC l2);itwas vacuum-p acked s tored a t4℃for three days,shea r force and m yofib ril fragm enta tion index(M FI)was m easured,and m yofib ril fragm enta tion was obse rved w ith a tom ic force m ic roscop y(AFM)wha teve r results we re comp a red w ith.【Result】The results of the three kindsof de te rm ina tion m e thod we re the sam e bas ica lly.But the re was a little d iffe rent.M yofib ril fragm enta tion deg ree was intuitive ly reflec ted by AFM obse rva tion.【Conc lus ion】AFM can intuitive ly reflec t the beef tende rness change in tende riza tion.It can p e rfec t shea r force and M FIm easurem entm e thod on m orp hology.

a tom ic force m ic roscop e;beef tende rness;shea r force;m yofib ril fragm enta tion index

TS251.7

A

1002-0306(2010)02-0111-03

2009-03-19 ＊通訊聯(lián)系人

李林強(qiáng)(1971-),男,博士研究生,研究方向:畜產(chǎn)品及功能食品研究。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(xiàng) (nyhyzx07-035);國家科技支撐計劃-農(nóng)林動物育種專項(xiàng) (2006BAD01A10-3);陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程(2007ZDCY-01)。