食品中桃仁和杏仁過敏原成分的檢測

張 霞，張海英，高旗利，劉 培，張宏偉，鄭文杰

(天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461)

食品中桃仁和杏仁過敏原成分的檢測

張 霞，張海英，高旗利，劉 培，張宏偉，鄭文杰

(天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461)

目的：建立檢測食品中桃仁、杏仁過敏原成分的熒光PCR方法，比較國外3種ELISA試劑盒效果。方法：針對杏仁Pru du1基因設計引物及探針，建立熒光PCR方法。利用杏仁過敏原參考物質(zhì)對3個品牌的ELISA試劑盒的回收率進行比較。結(jié)果：建立的熒光PCR方法，具有很好的特異性；靈敏度為10mg/kg。結(jié)論：桃仁及杏仁過敏原成分熒光PCR檢測方法特異性好、靈敏度高，對食品中過敏原的檢測有重要的實際意義。

杏仁；Pru du1基因；熒光定量PCR

Abstract：Objectives:To establish a real-time PCR method for the detection of allergenic almond and peach seeds in food and compare with quantitative test kits for allergenic almond. Methods:On the basis of sequence analysis of thePru du1region, specific primers and probes were designed to develop a real-time PCR method using TaqMan probe for the identification of allergenic almond or peach seed residues in food. In order to compare with the test kits, recovery rates and detection limit of established real-time PCR were determined using the reference material of allergenic almond. Results:The established real-time PCR method was highly specific for the detection of allergenic almond. Its sensitivity was less than 10 mg/kg. Conclusion:The real-time PCR method is highly sensitive and specific, thereby providing an applicable method for the detection of allergenic almond and peach seeds in food.

Key words：almond；allergenicPru du1gene；fluorescence quantitative polymerase chain reaction

隨著食品工業(yè)的發(fā)展，食品過敏問題日益成為人們關注的焦點問題[1]。樹堅果是世界各國公認的引起人類食物過敏的8大主要過敏原之一。據(jù)美國FDA資料統(tǒng)計，在美國所有過敏反應中，花生和樹堅果引起的過敏占10%～47%。據(jù)美國統(tǒng)計，人們對堅果(包括杏仁、核桃等)、鳳梨和花生這幾類變應原大約影響1.1%美國的總?cè)丝赱2]，其中對花生過敏的最多，占總數(shù)的30%；而對杏仁過敏的患者亦占總數(shù)的10%以上。對于過敏患者，杏仁作為一種生食和加工兼用的食物，在日常生活中很難避免，因此會隨時威脅這一類人群的健康[3]。

薔薇科中的許多種如蘋果、梨、桃、李、杏等是著名的水果，扁桃仁及杏仁為干果。扁桃仁(Prunus dulcis)通常稱之為美國大杏仁，其屬于薔薇科、李亞科、桃屬、扁桃種[4]，引起過敏主要有4類蛋白質(zhì)：與致病相關的10種蛋白、類奇(異果)甜蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白及抑制蛋白。扁桃仁過敏蛋白基因標識為Prudu1至Pru du4[5]。

目前國外對過敏原成分的檢測研究主要集中在ELISA、PCR、熒光PCR檢測等方面[6-8]。FDA和美國官方分析化學家協(xié)會(AOAC)共同研究推薦使用的試劑盒均為ELISA方法。該方法可對食品中引起過敏的蛋白進行定量，但如果產(chǎn)品中蛋白質(zhì)遭到破壞，ELISA方法就檢測不到。相對而言，DNA比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，PCR方法較ELISA方法更為準確，并且避免了對大量抗體的需求[9]。由于兩種檢測方法各有利弊，本研究除建立熒光PCR檢測方法外，對3個品牌的杏仁過敏原ELISA試劑盒從原理、制樣及檢測各方面進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CTAB(每升含CTAB 20g、EDTA 7.4g、Tris 12.1g，用10g/100mL HCl溶液調(diào)pH值至8.0，將溶液高壓滅菌備用)；氯仿、異戊醇、Tris飽和酚、異丙醇、70%乙醇、TE 德國IFP公司；過敏原參考物質(zhì)(2、5、10、20、40mg/kg杏仁的黑巧克力)。所用試劑均為分析純級生化試劑。

TaqMan Universal PCR Master Mix 試劑盒 美國ABI公司；蛋白酶K(20mg/mL) 大連寶生物工程公司；3種品牌杏仁過敏原ELISA檢測試劑盒分別購自澳大利亞ELISA Systems公司、德國R-biopharm公司和美國Neogen公司。

1.2 儀器與設備

ABI PRISM 7000熒光PCR擴增儀 美國ABI公司；5417R離心機 Eppendorf公司；Bio Specmini DNA/RNA/蛋白分析儀 日本島津公司；uQuant酶標分析儀 瑞士Tecan公司；INE800電熱恒溫培養(yǎng)箱 德國Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

取200mg美國大杏仁研磨成粉狀，于1.5mL離心管中，加入600μL CTAB，15μL蛋白酶K，65℃溫育30min；加入500μL Tris飽和酚:氯仿:異戊醇(體積比25:24:1)混合液強烈振蕩，12000r/min離心15min；吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后12000r/min離心10min，棄上清液；用70%乙醇洗滌2～3次，吸棄，用200mL TE溶解(TE量視DNA沉淀多少而定)。用DNA/RNA/蛋白分析儀檢測其純度。

同法提取甜杏仁、苦杏仁、桃仁、李子、楊梅、蘋果、梨等果仁D N A。

1.3.2 熒光PCR檢測方法建立

1.3.2.1 引物及探針的設計

針對Pru du1基因(EU424249.1)設計一對引物，以美國大杏仁、桃仁、甜杏仁、苦杏仁、蘋果、李子、楊梅DNA為模板作PCR擴增及測序分析，設計區(qū)別于蘋果、李子、楊梅等其他薔薇科常見水果的特異性引物及TaqMan探針(已申請專利200910068848.7)。引物：Up:5＇-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3＇；Dn:5＇-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3＇；探針：5＇(FAM)-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC-(Eclipse) 3＇。

1.3.2.2 反應體系和反應條件

反應體系：TaqMan Universal PCR Master Mix 25μL，10μmol/L引物各2μL，10μmol/L TaqMan探針1.5μL，模板DNA 5μL，ddH2O 14.5μL。

反應條件：50℃保持2min，95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火40s，45個循環(huán)。

1.3.2.3 特異性實驗

特異性實驗分3組樣品進行，第1組針對食物中常見基質(zhì)成分如麥粉、大豆、粟米等；第2組針對同科屬的常食用水果如蘋果、梨、李子、楊梅、桃、杏等果仁；第3組針對常食用堅果類食品如核桃、栗子、松子、葵花仁、榛果、夏威夷果等，觀察有無交叉反應。

1.3.2.4 靈敏度實驗

分別取美國大杏仁、甜杏仁、苦杏仁做樣品添加實驗。將其切成小塊加入液氮研磨成糊狀，與面粉充分混勻得到1000、100、20、10、5mg/kg的混合物。

同樣以購得德國IFP公司的過敏原參考物質(zhì)(含2、5、10、20、40mg/kg杏仁的黑巧克力)做靈敏度實驗。

1.3.3 ELISA檢測試劑盒比較

分別從檢測樣品種類、樣品處理方法及時間、檢測時間、定量檢測范圍、標準品濃度及準確度方面對3種品牌的ELISA試劑盒進行比較。以回收率作為準確度評價指標。

取參考物質(zhì)作為實驗樣品，每種實驗樣品包括4個濃度水平。由2個實驗員操作。每個實驗員在酶標儀上完成的檢測內(nèi)容為：每個樣品取3份按照ELISA檢測方法進行樣品前處理及檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

采用CTAB法提取美國大杏仁、甜杏仁、苦杏仁、桃仁的DNA，DNA/RNA/蛋白分析儀檢測其純度，OD260nm/OD280nm值在1.46～1.83之間，DNA質(zhì)量濃度為90.8～183.3μg/mL，其余作特異性實驗的陰性樣品(蘋果、梨、李子、楊梅、麥粉、大豆、粟米、核桃、栗子、松子、葵花仁、榛果、夏威夷果)DNA質(zhì)量經(jīng)植物18S核糖體RNA基因通用引物PCR檢測其DNA質(zhì)量均符合后續(xù)實驗要求，結(jié)果見圖1。

圖1 18S核糖體RNA PCR電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 18S ribosomal RNA gene after polymerase chain reaction

2.2 特異性實驗

經(jīng)過3組特異性實驗結(jié)果顯示，對于食品中常見基質(zhì)如麥粉、粟米粉、大豆粉；不同屬的堅果類食品如核桃、栗子、松子、葵花仁、榛果、夏威夷果等具有很好的特異性，結(jié)果全部為陰性。對于同科的水果蘋果、梨、李子、楊梅等檢測為陰性。通過桃仁、甜杏仁、苦杏仁及美國大杏仁的Pru du/pu1基因測序結(jié)果顯示，具有高度同源性，建立的熒光PCR方法檢測均為陽性，結(jié)果見圖2。

圖2 杏仁過敏原熒光PCR特異性實驗Fig.2 Specificity of fluorescent PCR for the detection of allergenic almond

2.3 靈敏度實驗

美國大杏仁、甜杏仁、苦杏仁作添加實驗，添加量分別為1000、100、20、10、5mg/kg，應用熒光PCR方法均可檢測至5mg/kg，但循環(huán)數(shù)出現(xiàn)在42～43之間，熒光值偏低(圖3)，不好做出陽性判斷。應用IFP參考物質(zhì)做靈敏度檢測，5次重復結(jié)果兩次檢出5mg/kg添加量的參考物質(zhì)為陽性，結(jié)果不穩(wěn)定；對于10mg/kg參考物質(zhì)可穩(wěn)定檢出，沒有漏檢現(xiàn)象。該方法雖然最低可檢測到5mg/kg，但結(jié)果不穩(wěn)定，而且由于其熒光值偏低，具體檢測樣品時較難做出陰、陽性判斷，所以確定本方法的靈敏度為10mg/kg。

圖3 杏仁過敏原熒光PCR靈敏度實驗Fig.3 Sensitivity of fluorescent PCR for the detection of allergenic almond

2.4 ELISA檢測試劑盒比較

2.4.1 3種杏仁ELISA檢測結(jié)果

對于分別添加3種杏仁的樣品，3種品牌ELISA檢測試劑盒檢測均為陽性，回收率在80%～120%之間，說明國外公司的杏仁過敏原試劑盒并非只是針對美國大杏仁的特異性檢測試劑盒。

表1 ELISA試劑盒參數(shù)比較Table 1 Comparison between fluorescent PCR and ELISA kits

表2 ELISA試劑盒準確度驗證數(shù)據(jù)Table 2 Verification for accuracy of ELISA kits

2.4.2 3種品牌試劑盒技術參數(shù)對比

在針對杏仁過敏原蛋白檢測方面，三者從樣品提取、處理及檢測時間都大致相同。ELISA Systems試劑盒檢測樣品種類較其余二者較廣，定量檢測范圍大致相同，具體對比參數(shù)見表1。

2.5 3種試劑盒ELISA準確度實驗結(jié)果

根據(jù)兩個實驗員，每個水平樣品各取IFP參考物質(zhì)3份按照ELISA試劑盒檢測方法進行樣品前處理及檢測，并計算檢測平均值及回收率，結(jié)果見表2。

由表2可見，ELISA Systems試劑盒的回收率總體的回收率偏高在89%～130%之間。

3 結(jié)論與討論

本研究通過Pru du1基因建立的熒光PCR檢測方法在實驗中表明，不但可以檢測出美國大杏仁過敏原成分，同時可以檢測桃仁、甜杏仁及苦杏仁。桃(Prunus persica)與扁桃同屬于桃屬，也為4類主要過敏蛋白，其基因標識為Pru pu1至Pru pu4，二者具有高度同源性，達到96%～99%，無法區(qū)分。雖然杏(Prunus armeniaca)在分類學中屬薔薇科、李亞科、杏屬，其仁分為甜杏仁及苦杏仁，但是通過對其Pru du1基因PCR擴增測序分析，與桃仁及美國大杏仁同源性為100%。故建立可同時檢測桃仁、杏仁過敏原成分的熒光PCR方法。

3種ELISA試劑盒經(jīng)用IFP購買的參考物質(zhì)比對實驗表明，操作方便快捷，區(qū)別在回收率及定量檢出范圍及結(jié)果報告方面，ELISA Systems公司試劑盒的回收率總體偏低在84%～96%之間，其余兩公司回收率偏高，在89%～130%之間。ELISA Systems可定量檢出過敏原杏仁蛋白含量，定量范圍0.5～5.0mg/kg，同時可換算為杏仁含量，定量范圍為2.4～24.0mg/kg，結(jié)果既可出具過敏原蛋白含量，又可報告過敏物質(zhì)含量；其余兩個試劑盒均是直接給出杏仁物質(zhì)含量，無法得出杏仁蛋白含量。

目前國內(nèi)外對杏仁過敏原的檢測研究主要集中在ELISA、PCR、熒光PCR及生物傳感器檢測等方面[10-13]，熒光PCR法與ELISA法是最常用的過敏原檢測方法。ELISA是一種傳統(tǒng)的檢測過敏原的方法，它具備直接的優(yōu)點，這也是其普遍使用ELISA方法進行檢測的最根本原因。過敏原本身就是蛋白質(zhì)，檢測蛋白質(zhì)存在與否最能夠說明該產(chǎn)品是否會引起人過敏。除此之外，ELISA方法還有一個優(yōu)點就是靈敏度比較高。熒光PCR方法是5～10mg/kg，即5mg/kg，而ELISA方法可達0.1mg/kg[14]，就目前而言ELISA方法靈敏度更高。但近年來，隨著生產(chǎn)加工工藝不斷復雜化，產(chǎn)品中添加了各種復雜的成分，如添加劑和色素等，ELISA的缺點也就暴露出來：第一，對于加工過的產(chǎn)品由于其蛋白質(zhì)成分遭到破壞，ELISA方法將不能檢測得出來而PCR方法不受影響，因此ELISA方法的準確性遭到質(zhì)疑；第二，ELISA方法檢測的通常是其中的一種蛋白質(zhì)，然而不同的人可能對不同的蛋白質(zhì)過敏，因此ELISA方法進行檢測也將不準確，可能有漏檢出現(xiàn)，這也是PCR方法的優(yōu)勢。所以應該分析情況，結(jié)合使用兩種方法。

[1] SICHERER S H, MUNOZ-FURLONG A, MURPHY R, et al.Symposium:Pediatric food allergy[J]. Pediatrics, 2003, 111(6):1591-1594.

[2] POLTRONIERI P, CAPPELLO M S, DOHMAE N, et al. Identification and characterization of the IgE-binding protein 2S albumin and congultin in almond (Prunus dulcis) seeds[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2002,128(2):97-104.

[3] 李東棟, 何韶衡. 食入性過敏原:杏仁蛋白組分的雙向電泳分析[J].細胞與分子免疫學雜志, 2004, 20(4):473-477.

[4] LADIZINSKY G. On the origin of almond[J]. Genetic Resources and Crop Evolution, 1999, 46:413-147.

[5] CHEN Lin, ZHANG Shuiming, ILLA E, et al. Genomic characterization of putative allergen genes in peach/almond and their synteny with apple[J]. BMC Genomics, 2008, 9:543-578.

[6] POMS R E, KLEIN C L, ANKLAM E. Methods for allergen analysis in food:a review[J]. Food Additives and Contaminants, 2004, 21(1):1-31.

[7] HOLZHAUSER T, WANGORSCH A, VIETHS S, et al. Polymerase chainreaction (PCR) for detection of potentially allergenic hazelnutresidues in complex food matrixes[J]. European Food Research and Technology,2000, 211(5):360-365.

[8] POMS R E, ANKLAM E, KUHN M. Polymerase chain reaction techniques for food allergen detection[J]. Journal of AOAC International,2004, 87(6):1391-1397.

[9] TORP A M, OLESEN A, STEN E. Specific, semi-quantitative detection of the soybean allergen Gly m Bd 30K DNA by PCR[J]. Food Control,2006, 17(5):30-36.

[10] ACOSTA M R, ROUX K H, TEUBER S S, et al. Production and characterization of rabbit polyclonal antibodies to almond (Prunus dulcisL.) major storage protein[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47(10):4053-4059.

[11] BARGMAN T J, RUPNOW J H, TAYLOR S J. IgE-binding protein in almonds (Prunus amygdalus):identification by immunoblotting with sera from almond allergic adults[J]. J Food Sci, 1992, 57(3):717-720.

[12] HLYWKA J J, HEFLE S L, TAYLOR S L. A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of almonds in foods[J]. J Food Prot, 2000, 63(2):252-257.

[13] LISA C, CHRIS R T, LIGLER S. Applications of array biosensor for detection of food allergens[J]. Journal of AOAC International, 2004, 87(6):1498-1502.

[14] HOLZHAUSER T, VIETHS S. Quantitative sandwich ELISA for determination of traces of hazelnut (Corylus avellana) protein in complex food matrixes[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47(10):4209-4218.

Allergen Detection of Almond and Peach Seeds in Food

ZHANG Xia，ZHANG Hai-ying，GAO Qi-li，LIU Pei，ZHONG Hong-wei，ZHENG Wen-jie
(Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Tianjin 300461, China)

Q789

A

1002-6630(2010)18-0220-04

2009-11-18

國家公益性行業(yè)科研專項(10-46-1)

張霞(1975—)，女，工程師，碩士，研究方向為微生物檢測。E-mail：zhangxia_75@126.com