• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    梅花鹿鹿筋膠原蛋白提取工藝條件優(yōu)化

    2010-10-19 05:27:16徐云鳳李蕓彤趙大慶
    食品科學(xué) 2010年18期
    關(guān)鍵詞:沸水醋酸膠原蛋白

    張 鶴,趙 雨*,徐云鳳,李蕓彤,趙大慶

    (長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心,吉林 長春 130117)

    梅花鹿鹿筋膠原蛋白提取工藝條件優(yōu)化

    張 鶴,趙 雨*,徐云鳳,李蕓彤,趙大慶

    (長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心,吉林 長春 130117)

    為應(yīng)用胃蛋白酶酶解法從鹿筋中提取制備膠原蛋白。采用單因素試驗和正交試驗篩選出鹿筋膠原蛋白提取的最佳條件為醋酸體積分?jǐn)?shù)5.5%、料液比1:7(mL/g)、浸提時間14h,胃蛋白酶與底物比1:1000(g/g)、酶解時間24h。驗證實驗結(jié)果表明,采用本方法提取的鹿筋膠原蛋白收率為74.56%,蛋白含量為65.54%。本實驗優(yōu)選所得梅花鹿鹿筋膠原蛋白提取工藝,方法簡便,提取率高。

    鹿筋;膠原蛋白;胃蛋白酶;高效凝膠色譜

    Abstract:Pepsin hydrolysis was used to extract and prepare collagen from deer tendons. The optimal extraction conditions were explored by single factor experiments and orthogonal experiments to be acetic acid concentration of 5.5%, material-to-liquid ratio of 1:9, extraction time of 10 h, pepsin-substrate ratio of 1:1000, and hydrolysis time of 24 h. The yield of deer tendon collagen was 74.56% and protein content was 65.54%. The optimized extraction method for deer tendon collagen was characteristic of simple operation and high extraction rate.

    Key words:deer tendon;collagen;pepsin;HPGFC

    鹿筋是鹿科動物梅花鹿(Cervus nipponTemminck)的四肢干燥筋,始載于《唐本草》[1],用于治療腎虛手足無力、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、勞損、轉(zhuǎn)筋等癥。膠原(collagen)是細(xì)胞外基質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),占人體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%~30%,相當(dāng)于人體質(zhì)量的6%,是構(gòu)成皮膚、韌帶、軟骨、肌腱等結(jié)締組織或器官的主要成分,起著支撐器官、保護(hù)機體的功能。膠原具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu),相對分子質(zhì)量大約為30萬,不溶于水;膠原蛋白是膠原的水解產(chǎn)物,具有較小的相對分子質(zhì)量,可溶于冷水,并且易降解,易被人體消化吸收[2]。近年來膠原蛋白不僅在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3],現(xiàn)有研究表明其具有降血壓、抗衰老、增加骨密度、降低甘油三酯和膽固醇的功能,并且可以補充體內(nèi)某些必需的微量元素等多種生理活性[4-6]。目前,關(guān)于膠原蛋白提取工藝的研究報道很多[7-9],本實驗主要研究酶法提取鹿筋中膠原蛋白,為揭示鹿筋的臨床功效以及開發(fā)功能產(chǎn)品提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    梅花鹿鹿筋 吉林省長春市雙陽區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn);胃蛋白酶(1:3000)、牛血清白蛋白 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;凝膠色譜柱標(biāo)準(zhǔn)分子量試劑(相對分子質(zhì)量依次為6500、13700、29000、43000、75000) GE Healthcare公司;Folin酚試劑 上海荔達(dá)生物技術(shù)有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鈉 美國Fluka公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    1100型高效液相色譜儀 美國Aglient公司;TSKgelG2000SW(XL)凝膠色譜柱 Tosoh公司;Uvmini-1240紫外分光光度計 日本島津儀器有限公司;PHS-25數(shù)顯酸度計、PL230電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;TGL-20B臺式高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;LL3000凍干機 瑞典Jouna Nordic公司;DZKW恒溫水浴箱 北京市永光明醫(yī)療儀器;WFO烘箱 上海愛郎儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 鹿筋的處理

    將新鮮鹿筋去脂肪、皮和筋膜后,切成0.5~1cm3的小塊,然后用生理鹽水反復(fù)清洗去除血和脂肪,再用蒸餾水沖洗干凈,置-20℃冰箱中保存。

    1.3.2 鹿筋膠原蛋白提取工藝

    將鹿筋解凍,酸溶液浸泡好后,置于100℃沸水浸提至其完全溶解,將水解液離心(4000r/min、30min、30℃),向上清液中加入胃蛋白酶,37℃酶解,酶解得到膠原蛋白,加熱使酶解液溫度達(dá)到80℃以上10min,使胃蛋白酶失活。離心(4000r/min、30min、4℃)后的上清液用NaOH溶液調(diào)pH7~7.5,濃縮,0.45μm濾膜過濾,濾液凍干,所得為鹿筋膠原蛋白。

    1.3.3 提取膠原蛋白的評價指標(biāo)

    當(dāng)酸的量不足時,鹿筋在100℃沸水中不會完全溶解,結(jié)果導(dǎo)致膠原蛋白提取率降低;若酸的量適中時,鹿筋在100℃沸水中可以完全溶解;若酸的量過高時,則導(dǎo)致部分氨基酸結(jié)構(gòu)破壞,如谷氨酰胺、天冬酰胺和色氨酸殘基會被破壞,因此浸提液醋酸體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時間以鹿筋在100℃沸水中完全溶解所用時間作為評價指標(biāo);酶解條件的選擇是應(yīng)用高效凝膠色譜法,依據(jù)膠原水解后的相對分子質(zhì)量分布確定最佳的胃蛋白酶用量及酶解時間。

    1.3.4 蛋白含量測定

    采用Folin-酚試劑盒測膠原蛋白含量。

    1.3.5 單因素試驗

    1.3.5.1 不同醋酸體積分?jǐn)?shù)對提取的影響

    稱取30g鮮鹿筋5份,加入配好的體積分?jǐn)?shù)0.57%、1%、3%、5%、8%醋酸溶液500mL,4℃浸泡2d后,100℃沸水浸提,根據(jù)鹿筋在100℃沸水中完全溶解時間來確定浸提鹿筋的最佳醋酸體積分?jǐn)?shù)。

    1.3.5.2 不同料液比對提取的影響

    稱取30g鮮鹿筋5份,按料液比1:5、1:6、1:8、1:10、1:12(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)5%的醋酸溶液,4℃浸泡2d后,100℃沸水浸提,根據(jù)鹿筋在100℃沸水中完全溶解時間來確定醋酸浸提鹿筋的最佳料液比。

    1.3.5.3 浸提時間對提取影響

    稱取30g鮮鹿筋5份,按料液比1:8,加入體積分?jǐn)?shù)5%的醋酸溶液置于4℃冰箱中,分別浸泡6、12、24、36、48h后,100℃沸水浸提,根據(jù)鹿筋在100℃沸水中完全溶解時間來確定醋酸浸提鹿筋的最佳浸提時間。

    1.3.6 正交試驗

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,對醋酸體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、浸提時間(C)3個因素,每個因素取3個水平,采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗,對鹿筋膠原蛋白提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

    1.3.7 酶量、酶解時間的選擇(高效凝膠色譜法)

    1.3.7.1 高效凝膠色譜條件

    色譜柱為TSKgelG2000SW(XL);流動相為0.1mol/L Na2HPO4、0.1mol/L NaH2PO4、0.1mol/L Na2SO4,pH6.6;流速為0.5mL/min;進(jìn)樣量為20μL;檢測波長為230nm。

    1.3.7.2 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線

    含有5種不同相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的溶液(相對分子質(zhì)量依次為6500、13700、29000、43000、75000),按上述高效液相凝膠色譜條件進(jìn)樣。以相對分子質(zhì)量為橫坐標(biāo)、保留時間為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?;貧w方程為y=-0.0788x+21.36,r=0.9975。

    1.3.7.3 酶量、酶解時間的試驗設(shè)計

    配制質(zhì)量濃度為0.01g/mL胃蛋白酶溶液,用HCl溶液調(diào)pH1.90。取3mL鹿筋100℃沸水浸提液按酶與底物比為1:500、1:800、1:1000、1:1500(g/g),加入胃蛋白酶溶液,37℃酶解24h,分別在0、6、12、24h時取樣100 μL,加100μL流動相溶液,混勻后,0.2μm濾膜過濾后進(jìn)樣。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果

    2.1.1 醋酸體積分?jǐn)?shù)的確定

    圖1 不同醋酸體積分?jǐn)?shù)對完全溶解時間的影響Fig.1 Effect of acetic acid concentration on deer tendon collagen extraction (reflected by required time for complete dissolution of deer tendon in 100 ℃ water, hereinafter the same)

    根據(jù)圖1可以看出,隨著醋酸體積分?jǐn)?shù)的增加鹿筋完全溶解時間減少,5%與8%完全溶解時間相差很小,因此采用醋酸體積分?jǐn)?shù)為5%。

    2.1.2 料液比的確定

    從圖2可以看出,料液比越低完全水解所用時間越短,增加醋酸會引入更多的鹽,降低蛋白含量,綜合考慮選取料液比為1:8。

    圖2 不同料液比對完全溶解時間的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on deer tendon collagen extraction

    2.1.3 浸提時間的確定

    圖3 浸提時間對完全溶解時間的影響Fig.3 Effect of extraction time on deer tendon collagen extraction

    從圖3可以看出,6h水煮時間較長,而12、24、36h完全溶解時間相差很少,所以綜合考慮選取浸提時間為12h。

    2.2 正交試驗結(jié)果

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,確定正交試驗的因素和水平見表1。正交試驗結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

    表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

    表2結(jié)果表明,影響鹿筋中膠原蛋白提取的各因素主次順序是A>C>B;表3結(jié)果表明,A和C因素對鹿筋膠原蛋白提取影響有顯著性(P<0.05),而B因素影響較小(P>0.05),對于料液比可根據(jù)實際情況加以選擇,本實驗選擇的料液比為1:7。因此,優(yōu)選出最佳的提取工藝為A3C3B1,即醋酸體積分?jǐn)?shù)為5.5%、浸提時間為14h、料液比為1:7。

    表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design layout and experimental results

    表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis for deer tendon collagen extraction with various extraction conditions

    2.3 酶量的確定

    圖4 不同酶量水解鹿筋膠原的高效凝膠色譜圖Fig.4 HPGFC chromatograms of hydrolyzed collagen at different pepsin-to-substrate ratios

    從圖4可以看出,未酶解時樣品洗脫峰的保留時間為20.50min;酶與底物比1:1500、24h樣品峰的保留時間在22.71min;酶與底物比1:1000、24h樣品峰的保留時間在24.70min和29.56min;酶與底物比1:800、24h樣品峰的保留時間在24.03min和30.23min;酶與底物比1:500、24h樣品峰的保留時間在24.20min和30.39min。從此數(shù)據(jù)可以看出,鹿筋膠原隨著酶量的增加,酶解后膠原蛋白的相對分子質(zhì)量逐漸降低,而1:1000、1:800和1:500樣品水解程度相差較小。綜合考慮選用酶與底物比1:1000。

    2.4 酶解時間的確定

    圖5 不同酶解時間水解鹿筋膠原的高效凝膠色譜圖(酶與底物比1:1000樣品)Fig.5 HPGFC chromatograms of hydrolyzed collagen at different hydrolysis time points (1:1000 pepsin-to-substrate ratio)

    從圖5可以得出,未酶解時樣品洗脫峰的保留時間為20.50min,由1.3.6.2節(jié)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可得,此時樣品的相對分子質(zhì)量主要為10910。隨著酶解時間的延長,樣品的水解程度不斷增加,酶解24h樣品峰的保留時間為24.70min和29.56min,此時樣品的相對分子質(zhì)量主要在6500以下,說明水解較好,大分子的膠原已完全水解成小分子的膠原蛋白。綜合考慮最佳的酶解時間為24h。

    2.5 驗證實驗

    綜上所得的最佳工藝為醋酸體積分?jǐn)?shù)5.5%、料液比1:7(mL/g)、浸提14h,胃蛋白酶與底物比為1:1000(g/g)、酶解24h。稱取已處理好的鮮鹿筋30g,按最佳提取工藝加入5.5%醋酸210mL浸提14h,將浸泡后的鹿筋于100℃沸水浸提至其完全水解,將水解液離心(4000r/min、30min、30℃),向上清液中加入胃蛋白酶0.03g,37℃酶解24h,酶解得到膠原蛋白,加熱使酶解液溫度達(dá)到80℃以上10min,使胃蛋白酶失活。離心(4000r/min、30min、4℃)后的上清液用NaOH溶液調(diào)pH7~7.5,濃縮,0.45μm濾膜過濾,濾液凍干,稱量,計算膠原蛋白含量,結(jié)果見表4。

    表4 驗證實驗結(jié)果Table 4 Verification of optimized extraction conditions of deer tendon collagen

    從表4可以看出,3組樣品平均膠原蛋白收率為74.56%,平均蛋白含量為65.54%。

    3 討 論

    由于膠原是不溶于水的高分子質(zhì)量物質(zhì),中性條件下將它直接通過鹿筋組織中提取出來較為困難,而膠原可在酸性或堿性條件下發(fā)生酸膨脹或堿膨脹,破壞膠原肽鏈間的氫鍵和離子鍵乃至共價鍵,使膠原結(jié)構(gòu)松散,易溶于熱水,并易被蛋白酶水解。在此過程中,pH值對其影響很大[10-11]。一般情況下,堿水解得到的大多數(shù)是D-氨基酸或外消旋氨基酸,得到的蛋白已失去了營養(yǎng)價值[12];酸水解時若酸的量過高時,則導(dǎo)致部分氨基酸結(jié)構(gòu)破壞,如谷氨酰胺、天冬酰胺和色氨酸殘基會被破壞。因此對于提取鹿筋中膠原蛋白選擇適宜的浸提液條件很重要。醋酸為弱酸,低濃度的醋酸對氨基酸結(jié)構(gòu)影響較小,且有報道表明采用醋酸提取膠原蛋白,提取率較高[13]。

    在人體中,胃蛋白酶是一種消化性蛋白酶,由胃中的胃黏膜主細(xì)胞分泌,酶切蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸或酸性氨基酸所形成的肽鍵,可將食物中的蛋白質(zhì)分解成易被人體吸收的小肽段。本實驗采用胃蛋白酶水解鹿筋膠原,模擬胃液環(huán)境,使水解得到的膠原蛋白更易被人體消化吸收[14-15]。

    高效凝膠色譜柱是根據(jù)分子篩原理,測定蛋白分子質(zhì)量分布。本實驗酶解鹿筋膠原時胃蛋白酶的酶量和酶解時間都是應(yīng)用高效凝膠色譜法,得到水解樣品洗脫峰的保留時間,依據(jù)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定最佳的胃蛋白酶用量及酶解時間。此方法確定樣品酶解條件方法簡單、準(zhǔn)確度高。

    本實驗對鹿筋膠原蛋白的提取工藝進(jìn)行了研究,得到最佳工藝是醋酸體積分?jǐn)?shù)為5.5%、料液比為1:7(g/mL)、浸提14h、胃蛋白酶與底物比是1:1000(g/g)、酶解時間為24h,酶解得到鹿筋膠原蛋白收率為74.56%,蛋白含量為65.54%。在酶解后的濃縮,調(diào)中性過程中有少量的鹽和灰分等成分引入,對產(chǎn)品的純度產(chǎn)生了一定的影響。因此在實際生產(chǎn)中還應(yīng)對產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的純化處理。

    [1] 蘇敬. 唐本草[M]. 上海:上海衛(wèi)生出版社, 1957:210.

    [2] 蔣挺大, 張春萍. 膠原蛋白[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2001:29.

    [3] 薛艷麗. 膠原蛋白與美容[J]. 中國實用醫(yī)藥, 2006, 1(9):84.

    [4] 陳靜濤, 徐政, 顧其勝. 膠原蛋白研發(fā)的最新進(jìn)展[J]. 上海生物醫(yī)學(xué)工程, 2004, 25(2):52-55.

    [5] 任俊莉, 付麗紅, 邱化玉. 膠原蛋白應(yīng)用及其發(fā)展前景[J]. 中國皮革,2004, 33(1):36-38.

    [6] 李彥春, 程寶箴, 靳立強. 膠原蛋白的應(yīng)用[J]. 皮革化工, 2002, 19(3):11-14.

    [7] 王信蘇, 汪之和. 草魚魚鱗膠原蛋白的提取[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2006(4):148-150.

    [8] 趙勝年. 酶解鮮豬皮提取水解膠原蛋白的研究[J]. 食品工業(yè)科技,1998(5):16-17.

    [9] 王建輝, 李琦, 劉在群, 等. 鹿皮膠原的提取與性質(zhì)[J]. 吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報, 2001(1):106-108.

    [10] 位紹紅, 許永安. 明膠提取工藝及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 福建水產(chǎn),2007(2):67-71.

    [11] 呂坪, 杜玉枝, 魏立新. 酶法制備明膠的研究進(jìn)展[J]. 明膠科學(xué)與技術(shù), 2006, 26(4):170-175.

    [12] 張應(yīng)年, 李生英, 朱彥榮. 人體必需氨基酸消旋化作用分析及應(yīng)用[J]. 中國食品與營養(yǎng), 2005(11):26-28.

    [13] 羅發(fā)興, 薛新順, 羅志剛. 酸溶液對豬皮中膠原蛋白溶出率的影響[J]. 中國釀造, 2006(9):9-11.

    [14] 王川, 李燕, 馬志英, 等. 幾種酶法從豬皮中提取膠原蛋白的對比研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(1):201-204.

    [15] 菅景穎, 張志勝. 酶解膠原蛋白研究進(jìn)展[J]. 肉類研究, 2005(5):26-28.

    Optimization of Extraction Conditions for Deer Tendon Collagen

    ZHANG He,ZHAO Yu*,XU Yun-feng,LI Yun-tong,ZHAO Da-qing
    (Chinese Medicine and Bio-engineering Research Center, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

    R284.2

    A

    1002-6630(2010)18-0014-04

    2009-12-23

    “十一五”國家科技支撐計劃項目(2007BAI38B06);吉林省科技支撐計劃項目(20096042)

    張鶴(1985—),女,碩士研究生,主要從事中藥有效成分研究。E-mail:zhang_he_19850123@163.com

    *通信作者:趙雨(1972—),男,教授,博士,主要從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail:cnzhaoyu@yahoo.com.cn

    猜你喜歡
    沸水醋酸膠原蛋白
    醋酸鈣含量測定方法的對比與優(yōu)化
    云南化工(2021年11期)2022-01-12 06:06:20
    沸水浴消解-原子熒光光譜法測定土壤及水系沉積物中5種元素
    圖說醋酸
    廣州化工(2020年8期)2020-05-19 06:23:56
    治毛囊炎
    婦女生活(2019年3期)2019-03-18 01:59:58
    想不到你是這樣的膠原蛋白
    Coco薇(2017年12期)2018-01-03 21:27:09
    像雞蛋一樣面對沸水
    美國肉參膠原蛋白肽對H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用
    膠原蛋白在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展前景分析
    梭魚骨膠原蛋白的提取及其性質(zhì)
    醋酸甲酯與合成氣一步合成醋酸乙烯
    啦啦啦啦在线视频资源| 国产高潮美女av| 午夜福利18| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 18禁黄网站禁片免费观看直播| 哪里可以看免费的av片| 久久亚洲真实| 成年女人毛片免费观看观看9| 国内精品久久久久精免费| 色综合色国产| 色在线成人网| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久九九精品影院| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品精品国产色婷婷| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲图色成人| 少妇高潮的动态图| av国产免费在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产淫片久久久久久久久| 久久久久久久久久久丰满 | 国产成年人精品一区二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲成a人片在线一区二区| 日日夜夜操网爽| 欧美日韩综合久久久久久 | 三级毛片av免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 99久久精品热视频| 日本 欧美在线| 性欧美人与动物交配| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲第一电影网av| 国产乱人伦免费视频| 搡老岳熟女国产| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产成人av教育| 国产精品电影一区二区三区| 国产一区二区三区视频了| 我的女老师完整版在线观看| 性色avwww在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲无线在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲电影在线观看av| 免费av毛片视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 免费看日本二区| 欧美日本视频| 国产精品福利在线免费观看| 制服丝袜大香蕉在线| 热99re8久久精品国产| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产视频一区二区在线看| 国产 一区精品| 日本免费a在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成人特级黄色片久久久久久久| 美女免费视频网站| 我要搜黄色片| 成年女人毛片免费观看观看9| 一个人看视频在线观看www免费| av中文乱码字幕在线| 日韩强制内射视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 直男gayav资源| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 中亚洲国语对白在线视频| 日本三级黄在线观看| 亚洲色图av天堂| 色噜噜av男人的天堂激情| 岛国在线免费视频观看| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美最新免费一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 久久久色成人| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲成人久久性| 波多野结衣高清作品| 久久午夜亚洲精品久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产免费一级a男人的天堂| 精品午夜福利在线看| 禁无遮挡网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 悠悠久久av| 麻豆国产97在线/欧美| 简卡轻食公司| 精品国内亚洲2022精品成人| av天堂中文字幕网| 又粗又爽又猛毛片免费看| 少妇人妻一区二区三区视频| 美女黄网站色视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 色播亚洲综合网| 99riav亚洲国产免费| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产伦在线观看视频一区| 免费av不卡在线播放| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 两个人视频免费观看高清| 精品久久久久久久末码| 国产美女午夜福利| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 中文在线观看免费www的网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 白带黄色成豆腐渣| ponron亚洲| 一级a爱片免费观看的视频| 丰满的人妻完整版| 综合色av麻豆| 日韩av在线大香蕉| 老司机福利观看| 国产精品国产高清国产av| 最新中文字幕久久久久| www.www免费av| 亚洲在线自拍视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 18禁在线播放成人免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩精品中文字幕看吧| 免费av毛片视频| 久久午夜亚洲精品久久| 国产亚洲精品综合一区在线观看| eeuss影院久久| 国产精品久久视频播放| 99热精品在线国产| av中文乱码字幕在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品,欧美在线| 亚洲国产色片| 日韩欧美在线乱码| www日本黄色视频网| 亚洲精品影视一区二区三区av| 黄色丝袜av网址大全| 全区人妻精品视频| 国国产精品蜜臀av免费| 国产v大片淫在线免费观看| 国产黄片美女视频| 99热只有精品国产| 很黄的视频免费| 欧美激情国产日韩精品一区| 99久久精品热视频| 午夜爱爱视频在线播放| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 此物有八面人人有两片| av视频在线观看入口| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日本黄色视频三级网站网址| 99在线人妻在线中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 91狼人影院| 午夜福利欧美成人| 99riav亚洲国产免费| 成人欧美大片| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产精品1区2区在线观看.| 日韩欧美三级三区| 久久久久性生活片| 精品福利观看| 亚洲内射少妇av| 在线看三级毛片| 一个人看视频在线观看www免费| 3wmmmm亚洲av在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久亚洲精品不卡| 欧美激情在线99| 久久草成人影院| 内射极品少妇av片p| 亚洲专区中文字幕在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 91在线观看av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 极品教师在线免费播放| 嫁个100分男人电影在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久人人精品亚洲av| 淫秽高清视频在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产精品野战在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 婷婷亚洲欧美| 国语自产精品视频在线第100页| h日本视频在线播放| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 在线a可以看的网站| 熟女电影av网| 身体一侧抽搐| 一区二区三区高清视频在线| 国产爱豆传媒在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 在线a可以看的网站| 嫩草影视91久久| 亚洲自偷自拍三级| 最后的刺客免费高清国语| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美高清成人免费视频www| 免费在线观看影片大全网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久色成人| 欧美潮喷喷水| 男女啪啪激烈高潮av片| 91久久精品国产一区二区成人| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 神马国产精品三级电影在线观看| 在线观看午夜福利视频| 91在线观看av| 天堂动漫精品| 国产精品久久电影中文字幕| 日本五十路高清| 欧美成人a在线观看| 国产精品野战在线观看| 国产精品一及| 久久99热6这里只有精品| 小说图片视频综合网站| 免费大片18禁| 美女被艹到高潮喷水动态| 色噜噜av男人的天堂激情| 久99久视频精品免费| 一个人看视频在线观看www免费| 精品久久久久久久久亚洲 | 色吧在线观看| a级毛片a级免费在线| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美精品啪啪一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 国产精华一区二区三区| 免费人成在线观看视频色| 熟女电影av网| 色综合亚洲欧美另类图片| 色播亚洲综合网| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产中年淑女户外野战色| 久久久久久久久久成人| 久久人人精品亚洲av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 51国产日韩欧美| 看黄色毛片网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久久久久大精品| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美+日韩+精品| www日本黄色视频网| 天天躁日日操中文字幕| 中文字幕免费在线视频6| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产精品,欧美在线| 亚洲国产色片| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 免费观看人在逋| 人妻久久中文字幕网| 在线观看av片永久免费下载| 午夜免费激情av| 不卡视频在线观看欧美| 舔av片在线| 亚洲人成网站高清观看| 久久亚洲精品不卡| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲电影在线观看av| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美高清成人免费视频www| 欧美黑人欧美精品刺激| 高清在线国产一区| 最新中文字幕久久久久| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产高潮美女av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 天天一区二区日本电影三级| or卡值多少钱| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲av成人av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美色视频一区免费| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av一区综合| 真人做人爱边吃奶动态| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 男人舔奶头视频| 日韩亚洲欧美综合| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产亚洲精品av在线| 国产高清视频在线观看网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 搡老岳熟女国产| 很黄的视频免费| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲四区av| 国产乱人伦免费视频| 一个人免费在线观看电影| 久久久久久久久中文| 久久精品影院6| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一区福利在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 久久国产乱子免费精品| 性欧美人与动物交配| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲中文字幕日韩| 一边摸一边抽搐一进一小说| 又紧又爽又黄一区二区| 嫩草影院入口| 看十八女毛片水多多多| 岛国在线免费视频观看| 内射极品少妇av片p| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日韩欧美在线乱码| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 看黄色毛片网站| 少妇的逼好多水| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产成年人精品一区二区| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品一及| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久久成人免费电影| 91麻豆av在线| eeuss影院久久| 国产精品伦人一区二区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久99热6这里只有精品| 此物有八面人人有两片| 美女免费视频网站| 亚洲无线在线观看| 日韩欧美在线乱码| 黄色视频,在线免费观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 最近在线观看免费完整版| 日韩中文字幕欧美一区二区| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美+日韩+精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 午夜视频国产福利| a级毛片a级免费在线| 国产在线男女| or卡值多少钱| 成人永久免费在线观看视频| 精品免费久久久久久久清纯| 国产毛片a区久久久久| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲avbb在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲美女视频黄频| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久99热这里只有精品18| 99热这里只有精品一区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产精品久久电影中文字幕| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 成人综合一区亚洲| 亚洲国产欧美人成| 中文资源天堂在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 九九热线精品视视频播放| av专区在线播放| 久久久久久久午夜电影| 人人妻人人看人人澡| or卡值多少钱| 一个人看视频在线观看www免费| 日本免费a在线| 免费看光身美女| 两个人视频免费观看高清| 黄色配什么色好看| 嫩草影院入口| 久久精品91蜜桃| 精品欧美国产一区二区三| 两个人的视频大全免费| 热99re8久久精品国产| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品伦人一区二区| 国产主播在线观看一区二区| 午夜久久久久精精品| 国产精品,欧美在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久久久久久久中文| 极品教师在线免费播放| 伊人久久精品亚洲午夜| 性插视频无遮挡在线免费观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| www.www免费av| 999久久久精品免费观看国产| 久久久国产成人免费| 在线观看av片永久免费下载| 美女高潮的动态| 五月伊人婷婷丁香| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 看片在线看免费视频| 免费高清视频大片| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩强制内射视频| 日本熟妇午夜| videossex国产| 一区二区三区激情视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99热6这里只有精品| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国产亚洲91精品色在线| 麻豆一二三区av精品| 极品教师在线免费播放| 色综合色国产| 毛片女人毛片| 亚洲av中文av极速乱 | 久久久久久伊人网av| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲av成人av| 亚洲中文日韩欧美视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | www.www免费av| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品一区二区三区视频在线| 欧美又色又爽又黄视频| 婷婷丁香在线五月| 一进一出好大好爽视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲电影在线观看av| 国产真实乱freesex| 日韩欧美国产一区二区入口| 免费看光身美女| 国产一区二区激情短视频| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美在线一区亚洲| 999久久久精品免费观看国产| 最近在线观看免费完整版| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲av电影不卡..在线观看| 97超视频在线观看视频| 日韩一区二区视频免费看| 18禁在线播放成人免费| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜福利视频1000在线观看| 国产三级中文精品| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品乱码久久久久久99久播| 赤兔流量卡办理| 69人妻影院| 精品不卡国产一区二区三区| 乱系列少妇在线播放| 国产精品福利在线免费观看| 色尼玛亚洲综合影院| 久久人人爽人人爽人人片va| 伦精品一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久性生活片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 乱人视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | av.在线天堂| 久9热在线精品视频| 午夜影院日韩av| 别揉我奶头 嗯啊视频| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲,欧美,日韩| 久久久久国内视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 女人被狂操c到高潮| 一进一出好大好爽视频| 中文字幕av在线有码专区| 久久6这里有精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 最后的刺客免费高清国语| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产亚洲91精品色在线| 搞女人的毛片| 国产亚洲精品久久久com| av天堂在线播放| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久亚洲真实| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲久久久久久中文字幕| 天堂√8在线中文| 搞女人的毛片| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜福利18| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲最大成人av| 波野结衣二区三区在线| 乱系列少妇在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 国内精品久久久久精免费| 日本免费a在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产日本99.免费观看| 丰满的人妻完整版| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 一区二区三区免费毛片| 久久久午夜欧美精品| 亚洲第一电影网av| 久久精品综合一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 人妻少妇偷人精品九色| 精品国产三级普通话版| 午夜视频国产福利| 最近最新免费中文字幕在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲第一电影网av| 久久久久久久久久久丰满 | 老女人水多毛片| 黄色视频,在线免费观看| 一级黄色大片毛片| 国产麻豆成人av免费视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 天堂网av新在线| 免费观看人在逋| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品,欧美在线| 亚洲性久久影院| 日韩欧美精品免费久久| 久久久午夜欧美精品| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 男女视频在线观看网站免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 色尼玛亚洲综合影院| 久久久精品欧美日韩精品| 九九在线视频观看精品| 两人在一起打扑克的视频| 免费电影在线观看免费观看| 国产精品99久久久久久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 国产一区二区在线观看日韩| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日本 欧美在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品色激情综合| 不卡视频在线观看欧美| 国产人妻一区二区三区在| 一级a爱片免费观看的视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99热只有精品国产| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲国产色片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲午夜理论影院| 一本久久中文字幕| 搡老岳熟女国产| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日本与韩国留学比较| 国内精品久久久久精免费| 免费搜索国产男女视频| 波多野结衣高清无吗| 真实男女啪啪啪动态图| 国产高清有码在线观看视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 黄色丝袜av网址大全| 综合色av麻豆| 成年女人看的毛片在线观看| 99久国产av精品| 丰满乱子伦码专区| 国产精品久久久久久久电影| 91麻豆av在线| 欧美性猛交黑人性爽| av.在线天堂| 校园春色视频在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品国产成人久久av| 中文亚洲av片在线观看爽| 男人狂女人下面高潮的视频| 变态另类丝袜制服| 又紧又爽又黄一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 极品教师在线视频| a级毛片a级免费在线| 欧美日韩黄片免| 日韩欧美在线二视频|