谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的研究

袁 建，鞠興榮，何 榮，王立峰,，朱小虎

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的研究

袁 建1，鞠興榮1，何 榮2，王立峰1,2，朱小虎1

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

為改善菜籽蛋白質(zhì)的凝膠特性，采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG)以單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究影響菜籽分離蛋白(RPI)凝膠特性的主要因素——TG質(zhì)量濃度、pH值、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。結(jié)果表明：反應(yīng)溫度和 pH 值對(duì)菜籽分離蛋白凝膠性的影響顯著，同時(shí)得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的最佳工藝條件，RPI質(zhì)量濃度1.5g/10mL、加酶量50U/g RPI、pH9.0、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間20min。

菜籽分離蛋白；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；凝膠性

Abstract：Enzymatic modification with transglutaminase (TG) was used to improve gel property of protein. The effects of TG amount, pH, reaction temperature and reaction time were explored on the basis of single factor experiments and orthogonal experiments. Results indicated that pH and reaction temperature exhibited a significant effect on gel strength on of rapeseed protein isolate (RPI). The optimal conditions for modifying gel property of RPI with TG were protein concentration of 1.5 g/10 mL,TG addition amount of 50 U/g, pH 9.0, reaction temperature of 40 ℃ and reaction time of 20 min.

Key words：rapeseed protein isolate (RPI)；transglutaminase (TG)；gel property

菜籽蛋白主要是由12S 球蛋白和1.7S或2S 蛋白質(zhì)組成，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其氨基酸組成符合FAO/WHO推薦模式值，PER值高于其他植物蛋白，甚至高于酪蛋白[1]。菜籽蛋白除了具有較好的營(yíng)養(yǎng)特性外，其吸水性、吸油性、起泡性和乳化性都優(yōu)于大豆蛋白，但是不具有形成凝膠的能力[2-3]，菜籽蛋白作為添加劑改善肉或香腸質(zhì)構(gòu)特性的應(yīng)用受到了限制。

目前，對(duì)于植物蛋白凝膠特性的研究，主要集中在對(duì)大豆分離蛋白凝膠性的研究上，通過(guò)物理、化學(xué)、酶和基因工程的方法，改變大豆蛋白的分子結(jié)構(gòu)，從而改變其凝膠特性[4-6]，而對(duì)菜籽蛋白凝膠特性的研究甚少，國(guó)內(nèi)還未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)菜籽蛋白限制性水解，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，探討谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性對(duì)菜籽蛋白凝膠特性的影響，為進(jìn)一步研究菜籽蛋白的凝膠性提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽分離蛋白[通過(guò)堿溶酸沉法制得[7]，由凱氏定氮法測(cè)得粗蛋白為82.55%(占干基質(zhì)量)]；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(100U/g，TG) 江蘇省泰興市一鳴精細(xì)化工有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；pHS-3C精密數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠；85-1磁力攪拌機(jī) 金壇市醫(yī)療儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；質(zhì)構(gòu)分析儀 英國(guó)Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 菜籽分離蛋白凝膠的制備

參照Tang等的方法[8]，并略有修改。取一定量菜籽蛋白，溶于0.1mol/L NaCl溶液中，配制成不同濃度、不同pH值的菜籽蛋白溶液；取一定量谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG)，溶于0.1mol/L NaCl溶液中，配制成不同濃度的酶溶液，調(diào)節(jié)pH值與菜籽蛋白溶液一致，將上述兩溶液用磁力攪拌器攪拌2h，使其充分溶解。各取5mL已溶解的菜籽蛋白溶液和酶溶液于10mL小燒杯得到不同酶與底物濃度比的蛋白-酶混合溶液。

將裝有蛋白-酶混合溶液小燒杯置于不同溫度的水浴中，反應(yīng)一段時(shí)間，取出置于95℃的水浴中保溫15min進(jìn)行滅酶，取出，冰水浴冷卻后于4℃的冰箱放置24h，取出陳化30min，測(cè)試，研究不同反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值、加酶量對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響。

1.3.2 菜籽蛋白凝膠特性的測(cè)定

用質(zhì)構(gòu)儀(TPA)測(cè)定菜籽蛋白的凝膠特性，選用直徑為10mm的圓柱狀平頭探頭(p/0.5)[9]。測(cè)前速度2mm/s；測(cè)試速度1mm/s；測(cè)后速度2mm/s；穿刺距離10mm；時(shí)間5s。做3次平行試驗(yàn)，取平均值得到凝膠質(zhì)構(gòu)參數(shù)，選取膠凝性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

膠凝性(g)：將半固體食品咀嚼至可吞咽時(shí)所做的功，與硬度和內(nèi)聚性有關(guān)。按照質(zhì)構(gòu)儀說(shuō)明書定義。

膠凝性=硬度×內(nèi)聚性

式中：硬度(g)為第一次壓縮(第一次咀嚼)過(guò)程中的峰值力；內(nèi)聚性為表示測(cè)試樣品經(jīng)過(guò)第一次壓縮變形后所表現(xiàn)出來(lái)的對(duì)第二次壓縮的相對(duì)抵抗能力，在曲線上表現(xiàn)為兩次壓縮所做正功之比(面積2/面積1)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 加酶量對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響

調(diào)蛋白-酶混合溶液pH6.0，水浴溫度50℃，保溫30min，加酶量(U/g RPI)分別為0、20、40、80、100。

1.3.3.2 pH值對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響

調(diào)蛋白-酶混合溶液pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，水浴溫度50℃，保溫30min，加酶量50U/g RPI。

1.3.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響

調(diào)蛋白-酶混合溶液pH9.0，保溫30min，加酶量50U/g RPI。水浴溫度(℃)分別為 20、30、40、50、60、70、80。

1.3.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響

調(diào)蛋白-酶混合溶液pH9.0，水浴溫度50℃，加酶量50U/g RPI。反應(yīng)時(shí)間(min)分別為10、20、30、40、50、60。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以加酶量、pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為影響因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性菜籽蛋白的凝膠特性的工藝條件，結(jié)果見表1(其中，RPI質(zhì)量濃度為1.5g/10mL)。

表1 工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 加酶量對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響

圖1 加酶量對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響Fig.1 Effect of TG amount on the gel property of rapeseed protein

由圖1可以看出，隨著TG加酶量的增加，RPI的凝膠強(qiáng)度不斷升高，超過(guò)60U/g時(shí)，RPI的凝膠強(qiáng)度開始下降，并隨著加酶量的升高，該值下降較為顯著。本試驗(yàn)中，加酶量達(dá)到60U/g RPI時(shí)，RPI的凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大值，說(shuō)明維系蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定所需的共價(jià)鍵的數(shù)目只有一定的飽和性，過(guò)多的酶量對(duì)蛋白的水解程度加深，反而不利于凝膠的空間網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致凝膠破裂強(qiáng)度在高加酶量時(shí)下降[10]；同時(shí)也可以看出，在不加TG的情況下，菜籽蛋白幾乎不形成凝膠，說(shuō)明TG的改性是菜籽蛋白形成凝膠的重要因素，而TG也常被用于蛋白質(zhì)的改性[11-12]。由曲線圖可以看出，40～60U/g RPI的加酶量變化不大，因此，以TG加酶量50U/g RPI進(jìn)行以下試驗(yàn)。

2.1.2 pH值對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響

圖2 pH值對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響Fig.2 Effect of pH on the gel property of rapeseed protein

圖2顯示了pH值對(duì)RPI凝膠性的影響?？梢钥闯觯趐H值較低情況下，隨著pH值的升高，凝膠強(qiáng)度有所波動(dòng)，在pH9.0時(shí)凝膠強(qiáng)度達(dá)到最高點(diǎn)，超過(guò)9.0時(shí)，隨著pH值的升高，RPI的凝膠強(qiáng)度不斷下降。這是因?yàn)轶w系pH值的改變一方面影響酶活性和穩(wěn)定性，另一方面影響CPI的溶解性，影響蛋白質(zhì)相互作用過(guò)程中的疏水作用與靜電作用之間的平衡[5]。另外，pH7.0處有一個(gè)低點(diǎn)，是因?yàn)閜H7.0是RPI的一個(gè)等電點(diǎn)，此pH值下其溶解性較低[13]。因此，最適 pH值為9.0，此條件下，RPI的凝膠性最好，可以達(dá)到21.5g。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)菜籽蛋白凝性膠的影響

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)菜籽分離蛋白凝性膠的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the gel property of rapeseed protein

由圖3所示，在TG加酶量50U/g RPI的條件下，RPI的凝膠強(qiáng)度隨反應(yīng)溫度的升高，呈先升高后降低趨勢(shì)，溫度在50℃時(shí)RPI的凝膠強(qiáng)度最大。這是因?yàn)?，一方面溫度影響酶的反?yīng)速率，溫度升高，反映速度加快，另一方面也影響酶的活性，高溫會(huì)使酶失活，酶對(duì)蛋白的改性能力減弱[14]。因此，反應(yīng)最適溫度為50℃。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響

由圖4可以看出，在反應(yīng)時(shí)間較短的情況下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，RPI的凝膠強(qiáng)度有所升高，反應(yīng)20min后RPI凝膠強(qiáng)度開始下降，最后趨于一個(gè)穩(wěn)定值。長(zhǎng)時(shí)間的水解反應(yīng)使RPI的凝膠強(qiáng)度有所減弱，但在0～60min內(nèi)，RPI凝膠強(qiáng)度變化不大，極差為3.15g。實(shí)驗(yàn)得出最適反應(yīng)時(shí)間為20min。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響Fig.4 Effect of reaction time on the gel property of rapeseed protein

2.2 工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

由表2可以看出，定義菜籽蛋白凝膠特性影響因素的主次順序?yàn)镃＞B＞A＞D，即反應(yīng)溫度對(duì)菜籽蛋白凝膠特性的影響較大，pH值、加酶量次之，反應(yīng)時(shí)間影響最小。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的最佳條件為A2B2C1D2，即加酶量50U/g RPI、pH9.0、反應(yīng)溫度40℃、處理時(shí)間20min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，菜籽蛋白的凝膠性可以達(dá)到23.65g，凝膠特性較好。

以影響因素D(反應(yīng)時(shí)間)為誤差項(xiàng)對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示，可以看出因素C(反應(yīng)溫度)對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響極顯著(F=117.34＞F0.01(2,2)=99.0，P＜0.01)，B(pH值)對(duì)菜籽蛋白凝膠性的影響顯著(F=22.92＞F0.05(2,2)=19.0，P＜0.05)，也就是說(shuō)，在實(shí)際操作過(guò)程中，只有嚴(yán)格控制該酶反應(yīng)的溫度和p H值，才能達(dá)到預(yù)期的目的。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for the gel property of rapeseed protein with various TG reaction conditions

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究了谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性菜籽蛋白凝膠性的影響因素。結(jié)果表明：反應(yīng)溫度對(duì)菜籽蛋白凝膠特性的影響較大，pH值、加酶量次之，反應(yīng)時(shí)間的影響最小，其中反應(yīng)溫度和pH值的影響較為顯著，實(shí)際操作中應(yīng)該嚴(yán)格控制這兩個(gè)條件。得出谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性菜籽蛋白凝膠性的最佳工藝條件為：RPI質(zhì)量濃度1.5g/10mL、加酶量50U/g RPI、pH9.0、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間20min，該條件下菜籽蛋白的凝膠性可以達(dá)到23.65g，凝膠性較好。

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Gel Property of Transglutaminase-modified Rapeseed Protein

YUAN Jian1，JU Xing-rong1，HE Rong2，WANG Li-feng1,2，ZHU Xiao-hu1
(1. Jiangsu Provincial Laboratory of Quality Control and Further Professing of Food and Oil, College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

TQ931

A

1002-6630(2010)18-0010-04

2009-11-19

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z331)；國(guó)家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2009C10045)

袁建(1965—)，男，教授，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：yuanjian@njue.edu.cn