乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)

楊桂連，秦守濤，劉 瓊，王春鳳*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)

楊桂連，秦守濤，劉 瓊，王春鳳*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

目的：構(gòu)建連接乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的非抗性重組質(zhì)粒。方法：以瑞士乳桿菌基因組DNA為模板，克隆胞外蛋白水解酶基因，連接到以thyA為選擇壓力的非抗性穿梭表達(dá)載體pW425et上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pW425et-R，轉(zhuǎn)化入thyA基因缺陷型E.coliX13感受態(tài)細(xì)胞，SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示該水解酶得到了表達(dá)。結(jié)果：成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pW425et-R，胞外蛋白水解酶基因在E.coliX13中得到正確表達(dá)。結(jié)論：成功地表達(dá)了乳酸菌胞外蛋白水解酶基因，可為進(jìn)一步制備具降血壓功能基因工程乳酸菌提供參考。

乳酸菌；胞外蛋白水解酶；降血壓肽；克隆；表達(dá)

Abstract：Objective:To construct a recombinant plasmid carrying extracellular protease gene fromLactobacillus. Methods:The extracellular protease gene was cloned from genomic DNA ofL. helveticusand inserted into the expression vector pW425et.Then the recombination plasmid was transformed into the competencethyAgene-mutantE. coliX13. The expressed protein was analyzed by SDS-PAGE. Results:The recombinant shuttle plasmid pW425et-R was constructed successfully and theLactobacillusextracellular proteinase gene was expressed inE. coliX13. Conclusion:Our research idea is feasible for the successful expression ofLactobacillusextracellular protease gene inE. coliX13, which will provide a basis for further preparation of recombinantLactobacilluswith anti-hypertensive function.

Key words：Lactobacillus；extracellular protease；anti-hypertensive peptide；cloning；expression

高血壓是一種慢性心腦血管疾病，可誘發(fā)冠心病、腦出血等心腦血管疾病，并引起患者心、腦、腎等器官損傷以及糖、脂質(zhì)代謝紊亂，該病己成為人類健康的第一殺手。

目前，世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)用于治療高血壓病的一線抗高血壓藥物在治療時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)疼痛、發(fā)燒、惡心等副作用。尋找天然、安全、食品來源的降壓物質(zhì)來治療高血壓引起廣大學(xué)者的關(guān)注。1970年在南美蝮蛇(Bothrops jararaca)毒液中發(fā)現(xiàn)一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(angiotensinⅠ-converting enzyme inhibitory peptides，ACEIP)[1-2]。之后眾多學(xué)者對(duì)于ACEIP的生理特征、作用機(jī)理、提取及合成方法等進(jìn)行了廣泛的研究。研究表明，除從天然物質(zhì)中分離提取以外，還可以利用蛋白酶水解食品蛋白獲得。Oshima等[3]首次通過蛋白酶水解食品蛋白中獲得ACEIP。隨后在幾乎所有的食品蛋白的單一蛋白酶或多種蛋白酶聯(lián)合水解物中獲得多種ACE抑制肽[4-8]，但該方法具有條件苛刻、設(shè)備要求精良、產(chǎn)量低以及副反應(yīng)多等缺點(diǎn)，因此難以推廣生產(chǎn)。目前除了蛋白酶水解法以外，微生物發(fā)酵法(特別是乳酸菌發(fā)酵法)成為獲得ACEIP的常用方法，并顯示出良好的開發(fā)潛力及應(yīng)用前景。

乳酸菌的降血壓作用在于其代謝產(chǎn)生的蛋白酶可以降解牛乳蛋白而產(chǎn)生ACEIP。Yamamoto等[9]用瑞士乳桿菌(L. helveticus)CP790所分泌的胞外蛋白水解酶水解牛乳酪蛋白，發(fā)現(xiàn)其水解物有較強(qiáng)的抗高血壓功能，并從中分離出降血壓活性肽。2004年Ueno等[10]從L. helveticusCM4中分離出一種分子質(zhì)量約67kD的酶，這種酶能夠特異水解多肽釋放出具有降血壓活性的小肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro。進(jìn)一步研究表明發(fā)酵乳制品降血壓作用的強(qiáng)、弱與發(fā)酵用乳酸菌的種類密切相關(guān)，其中以瑞士乳桿菌的蛋白水解能力最強(qiáng)，且其發(fā)酵的牛乳具有較強(qiáng)的抗高血壓活性[11-13]。

本研究設(shè)計(jì)特異性引物，以分離純化的蛋白水解能力較強(qiáng)的L. helveticusNL05的DNA為模板，進(jìn)行胞外蛋白水解酶基因的克隆。接著連接到以胸苷酸合成酶(thyA)基因?yàn)檫x擇壓力的穿梭表達(dá)載體pW425et上，構(gòu)建可在乳酸菌和大腸桿菌穿梭表達(dá)的重組質(zhì)粒pW425et-R；繼而轉(zhuǎn)化入thyA基因缺陷型E. coliX13感受態(tài)細(xì)胞，通過生長功能彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)篩選陽性重組體并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，以期為進(jìn)一步制備具降血壓功能重組基因功能乳酸菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

瑞士乳桿菌(L. helveticusNL05)、E.coliX13由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物微生態(tài)學(xué)研究室保存；以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的載體pW425et由本研究室構(gòu)建并保存[14]；pMD18-T-simple載體購自Takara生物公司。

1.2 試劑

T4DNA Ligase Promega公司；SacⅠ、KpnⅠ、ExTaqDNA聚合酶、dNTP、RNA酶、DNA Marker Takara公司；DNA凝膠回收試劑盒 Axygen公司；胸苷酸 美國Sigma公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

3-18K型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；Tgradient PCR儀 Whatman Biometra公司；DYCP-31A水平電泳儀 北京六一儀器廠；U-3400分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；TH2-82型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海醫(yī)療器械廠。

1.4 方法

1.4.1 目的基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank登錄的L. helveticus胞外蛋白水解酶基因序列(AB026985.1)設(shè)計(jì)特異性PCR引物：P1：5＇-＇(斜體下劃線部分分別為SacⅠ、KpnⅠ酶切位點(diǎn))，引物由大連TaKaRa公司合成。提取L.helveticusNL05 DNA[15]，以提取DNA為模板，以P1、P2為上下游引物，對(duì)胞外蛋白水解酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：10×ExTaqBuffer 5.0μL；dNTP(2.5mmol/L)4.0μL；上、下游引物(10 μmol/L)各1.0μL；ExTaq(5U/μL) 0.4 μL；加雙蒸水至50.0μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、55℃退火45s、72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取2μL進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后與pMD18-T-simple載體連接，酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒，送大連Takara公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較分析。

1.4.2 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)pMD18-T-simple-R和pW425et均以SacⅠ、KpnⅠ雙酶切。切膠回收純化后以T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物應(yīng)用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coliX13中，之后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB固體培養(yǎng)基(不添加胸腺嘧啶核苷)上培養(yǎng)，篩選陽性重組體。

1.4.3 乳酸菌胞外蛋白水解酶基因在E.coliX13中的表達(dá)

將篩選獲得的含有pW425et-R重組質(zhì)粒的陽性菌株接種在LB液體培養(yǎng)基(不含胸腺嘧啶核苷)中，37℃、180r/min培養(yǎng)過夜。取2mL接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.7。在培養(yǎng)基中添加IPTG(終濃度為1mmol/L)，加入之前取菌一次，之后每隔1h取一次菌液，取至7h。以同樣的方法誘導(dǎo)7h含空載體pW425et的E.coliX13作對(duì)照。

1.4.4 SDS-PAGE分析

將各個(gè)時(shí)間誘導(dǎo)收獲的菌液菌培養(yǎng)至OD600nm為0.7。取菌液1.5mL，4℃離心收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次，在沉淀菌體中加入100μL 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，重懸細(xì)菌沉淀。加入100μL 2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸10min，4℃冷卻。取上清15μL進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌胞外蛋白水解酶基因擴(kuò)增與序列測(cè)定

以提取的L.helveticusNL05 DNA為模板，PCR擴(kuò)增胞外蛋白水解酶基因。0.8%瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，在1350bp附近有一條單一的擴(kuò)增帶，與預(yù)期大小相符。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后與載體pMD18-T-simple連接、轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)行質(zhì)粒小量提取。經(jīng)電泳選取其中滯后的質(zhì)粒進(jìn)行SacⅠ、KpnⅠ酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。

圖1 胞外蛋白水解酶基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification products of extracellular protease gene

圖2 質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of recombinant plasmid pMD18T-b digested withSacI andKpnI

2.2 序列分析

將鑒定后的重組E.coli菌送大連Takara公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI在線BIAST分析發(fā)現(xiàn)該序列與GenBank中登錄的L.helveticusCP790胞外水解酶基因(AB026985.1)相似性為99.8%。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

分別對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T-simple-R和載體pW425et進(jìn)行SacⅠ、KpnⅠ酶切，回收純化后，以T4DNA ligase連接，隨后轉(zhuǎn)化至E.coliX13中，篩選后小量制備質(zhì)粒。將重組陽性質(zhì)粒用SacⅠ和KpnⅠ酶切后，電泳如圖3所示，得到了約4800bp的pW425et線性片段和1350bp的插入片段，表明已成功構(gòu)建含乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pW425et-R。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pW425et-R酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant pW425et-R based onKpnI-SacI digestion

2.4 SDS-PAGE分析

圖4 質(zhì)粒pW425et-R表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of pW425t-R expression products

SDS-PAGE結(jié)果顯示在大約49.5kD左右可見明顯的蛋白表達(dá)，空載體未出現(xiàn)，如圖4所示。分析上述經(jīng)過鑒定為陽性的菌株在各時(shí)間的表達(dá)情況，可見在0～2h蛋白表達(dá)量是隨著時(shí)間延長而逐漸增加，2h以后表達(dá)量基本穩(wěn)定。

3 討 論

Christiaens等[17]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可以作為基因工程菌表達(dá)外源基因，在信號(hào)肽的引導(dǎo)下目的蛋白直接分泌進(jìn)入上清，可以方便地獲得目的蛋白。Fu等[18]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可以轉(zhuǎn)化或表達(dá)保護(hù)性抗原基因或免疫調(diào)節(jié)因子，其作為受體菌表達(dá)內(nèi)源性或外源性蛋白在功能食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域具有誘人的前景和無窮的潛力。1995年Nakamura等[19]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓大鼠長期服用酸奶Calpis可抑制血壓上升，并從中提純、鑒定ACEIP，成為從乳酸菌發(fā)酵的牛乳中分離出ACEIP的首例報(bào)道。這一發(fā)現(xiàn)將乳酸菌、乳蛋白和ACE肽有機(jī)的結(jié)合在一起，為探索生產(chǎn)ACEIP的新方法指明了方向。隨著研究的不斷深入，在乳酸菌發(fā)酵的牛乳中分離出大量的生物活性肽類物質(zhì)，對(duì)其功能及生物特性研究表明具有良好的降血壓作用。因此，微生物發(fā)酵法成為制備乳源ACEIP研究方法。目前國內(nèi)對(duì)乳酸菌和乳源降壓肽的研究主要集中在乳酸菌菌種的篩選、發(fā)酵牛乳中降壓肽的分離提純及活性測(cè)定、發(fā)酵條件的優(yōu)化等方面[20-22]。由于種屬差異及乳酸菌本身蛋白酶分泌量有限，在發(fā)酵過程存在酶解效率低、副反應(yīng)多、蛋白利用率低、回收純化難度大等缺點(diǎn)，成為大量生產(chǎn)乳源ACEIP的瓶頸。因此，利用基因工程技術(shù)改造乳酸菌，增加其胞外蛋白水解酶的表達(dá)量，增強(qiáng)自身水解能力，同時(shí)在發(fā)酵期間相對(duì)地提高乳酸菌水解牛乳蛋白的效率，產(chǎn)生更多的生物活性小肽來降低血壓、降低膽固醇，成為新的探索方向。

本研究在已構(gòu)建得以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的可在大腸桿菌和乳酸菌中穿梭表達(dá)的非抗性表達(dá)載體pW425et基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建含有乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的非抗性重組質(zhì)粒pW425et-R，并轉(zhuǎn)化入thyA基因缺陷型E.coliX13中，篩選獲得陽性重組體，SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示可以正確表達(dá)該水解酶。本實(shí)驗(yàn)中使用的thyA基因缺陷的E.coliX13在普通的LB培養(yǎng)基上不能生長，當(dāng)轉(zhuǎn)入含有thyA基因重組質(zhì)粒pW425et-R后，可以在生長過程中表達(dá)胸苷酸合成酶，從而使thyA基因缺陷的E.coliX13在普通的LB平板上恢復(fù)生長，以便于篩選陽性重組體。同時(shí)在篩選過程中避免抗生素的介入，不僅解決了由于抗性基因漂移、擴(kuò)散及整合，對(duì)環(huán)境、人和動(dòng)物帶來生物安全性的問題，同時(shí)也加大了改變水解性能的重組基因乳酸菌的安全性和實(shí)用性，為將來在乳酸菌中表達(dá)蛋白水解酶提供理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步探索改變或增強(qiáng)天然乳酸菌的發(fā)酵性能，增加乳源ACEIP的產(chǎn)量，生產(chǎn)“食品級(jí)”降血壓食品、降血壓藥品及研究新型乳酸菌發(fā)酵制品提供參考。

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Cloning of Extracellular Protease Gene fromLactobacillusand Expression inEscherichia coli

YANG Gui-lian，QIN Shou-tao，LIU Qiong，WANG Chun-feng*
(College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Q939.99

A

1002-6630(2010)21-0254-04

2009-12-14

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z322；2006AA10A205)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671573；30700602；30870116)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20080104)

楊桂連(1978—)，男，講師，博士，主要從事動(dòng)物微生物免疫學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn

*通信作者：王春鳳(1972—)，女，教授，博士，主要從事動(dòng)物微生物免疫學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：wangchunfeng@jlau.edu.cn