Bacillus subtilisB2產(chǎn)1-脫氧野尻霉素(DNJ)發(fā)酵條件優(yōu)化

朱運(yùn)平，李秀婷，李里特

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

Bacillus subtilisB2產(chǎn)1-脫氧野尻霉素(DNJ)發(fā)酵條件優(yōu)化

朱運(yùn)平1，李秀婷1，李里特2

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

為探索制備含有1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojimycin，DNJ)的降血糖功能性食品的新方法，以產(chǎn)DNJ的菌株Bacillus subtilisB2為初始菌株，以價(jià)廉的農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物豆渣為原料，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，獲得富含功能因子DNJ的發(fā)酵液。結(jié)果表明：接種量對α-葡萄糖苷酶抑制活性影響不明顯，當(dāng)接種量大于104個(gè)/mL時(shí)，發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性均在20以上。而豆渣濃度、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH值及發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性影響較大，在豆渣質(zhì)量濃度30mg/mL，初始pH值6～8，發(fā)酵溫度40℃的條件下發(fā)酵48h，發(fā)酵液表現(xiàn)出較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。以Bacillus subtilisB2發(fā)酵豆渣的發(fā)酵液為原料開發(fā)含DNJ的降糖功能食品，可以大大提高豆渣的利用價(jià)值，為降糖功能食品的開發(fā)利用開辟新途徑。

1-脫氧野尻霉素；Bacillus subtilisB2；豆渣；降血糖；功能性食品

Abstract：To prepare a fermentation broth rich in 1-deoxynojimycin (DNJ) available for the development of hypoglycemic functional foods containing DNJ using soybean dregs, a low-cost byproduct of agricultural products processing, as fermentation substrate andBacillus subtilisB2 as fermentation strain, some fermentation conditions were optimized. The results indicated that the effect of inoculum size on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth was not significant. An inoculum size above 104CFU/mL resulted in aα-glucosidase inhibitory activity above 20. However, fermentation substrate concentration,medium initial pH and fermentation temperature and time had substantial effect on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth. After fermentation for 48 h under the conditions of fermentation substrate concentration 30 mg/mL, medium initial pH 6 － 8 and 40 ℃, a maximumα-glucosidase inhibitory activity was obtained.

Key words：1-deoxynojimycin;Bacillus subtilisB2; soybean dregs; hypoglycemic function; functional food

1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojimycin，DNJ)是一種α-葡萄糖苷酶強(qiáng)抑制劑，在糖尿病的治療及預(yù)防過程中有著重要作用，是目前糖尿病治療用藥米格列醇的合成前體[1]。DNJ不僅在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，在食品領(lǐng)域的作用也日漸凸顯。天然植物資源中，桑類(桑芽、桑葉、桑皮、桑根、桑籽等)各個(gè)組織及全蠶粉均含有一定量的DNJ，具有明顯α-葡萄糖苷酶抑制效果，我國古代就把桑葉用于中醫(yī)保健[2-3]。近年來，日本等國已經(jīng)允許以桑葉為原料的食品作為降血糖的功能性食品在市場上銷售[4]。但由于桑葉各個(gè)組織因DNJ含量的差異表現(xiàn)出對α-葡萄糖苷酶抑制效果存在一定的差異，同時(shí)，種植地區(qū)、桑樹的品種、生長階段都會對桑樹各組織中有效成分DNJ含量產(chǎn)生影響[5]，因此，以桑蠶類組織為原料生產(chǎn)降血糖功能性食品時(shí)，其有效成分DNJ的含量難以控制。

筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)從我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisB2具有產(chǎn)DNJ的能力，進(jìn)而提出了采用微生物發(fā)酵法制備含有DNJ的降血糖功能性食品的方法[6-7]。Bacillus subtilisB2產(chǎn)DNJ的最佳發(fā)酵條件有待進(jìn)一步探索，因此，本實(shí)驗(yàn)將對其發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基濃度、初始pH值、發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間等進(jìn)行研究。

豆渣是大豆加工產(chǎn)品如豆奶或豆腐加工過程中的副產(chǎn)品，中國、阿根廷、巴西、美國、日本等國家每年豆渣的產(chǎn)量很大[8-10]。豆渣中含有多種功能性成分，如膳食纖維、大豆蛋白、多糖、異黃酮、皂苷等，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值[11]。但由于豆渣含水量較高、保質(zhì)期短，這使得豆渣的利用受到一定的限制，大部分豆渣作為動物飼料直接喂養(yǎng)動物或者焚燒掉或者作為廢棄物堆放，不做任何利用，這造成了豆渣資源的極大浪費(fèi)[12]。為了對豆渣進(jìn)行綜合利用，本研究選取豆渣作為Bacillus subtilisB2的初始培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(B.subtilisB2)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院李里特實(shí)驗(yàn)室篩選。先在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基上活化16h，調(diào)整菌液濃度至106個(gè)/mL，作為豆渣發(fā)酵的菌懸液。

1.2 材料與試劑

大豆(小粒6號，2009年7月收獲)購于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。以小粒6號大豆為原料在實(shí)驗(yàn)室制備豆渣(水分含量85%、粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.65%、粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.37%、粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.22%、其他物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.76%)。

α-葡萄糖苷酶(Rat intestinal acetone powders)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenylα-D-glucopyranoside，4-NPG) Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 發(fā)酵條件對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

1.3.1 豆渣質(zhì)量濃度對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

以豆渣作為單一營養(yǎng)元素，對豆渣的添加濃度進(jìn)行選擇，添加質(zhì)量濃度分別為：10、20、30、40、50、60mg/mL。

1.3.2 培養(yǎng)基初始pH值對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

以0.1mol/L檸檬酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值為：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，在上述培養(yǎng)條件下，搖瓶培養(yǎng)48h后測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

采用不同溫度20、25、30、35、40、45、50℃對菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.4 接種量對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

將種子培養(yǎng)液稀釋到一定濃度，使得培養(yǎng)基中菌種初始濃度為103、104、105、106、107個(gè)/mL，搖瓶培養(yǎng)48h后測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.5 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分別為：0、12、24、36、48、60、72、84、96h。測定發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定[13]

因DNJ的含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性存在正相關(guān)關(guān)系，因此，在發(fā)酵過程中通過檢測發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性初步判斷DNJ的濃度。在96孔酶標(biāo)板上，每個(gè)樣品經(jīng)過7次連續(xù)2倍稀釋，得到一系列樣品稀釋液。經(jīng)過稀釋的樣品中加入50μLα-葡萄糖苷酶溶液(25mg/mL)，50μL 4-PNPG (0.9133 mg/mL)及 120μL 0.5mol/L的磷酸緩沖液(pH6.7)?；靹蚝笤?7℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)45 min。加入50μL碳酸鈉溶液(0.67mol/L)終止反應(yīng)，在波長405nm下用酶標(biāo)儀(Model 550酶標(biāo)儀，BIORAD Laboratories)測定吸光度。α-葡萄糖苷酶的抑制活性通過讀出的吸光度計(jì)算斜率值，用斜率表示抑制活性的高低。斜率越大，說明樣品的抑制活性越強(qiáng)，發(fā)酵液中有效成分DNJ的含量越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣質(zhì)量濃度對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

筆者在前期研究過程中，發(fā)現(xiàn)在LB培養(yǎng)基中添加豆渣、豆粉及淀粉這些附加培養(yǎng)物，發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶活性比單純用LB培養(yǎng)基顯著提高[6]?？紤]到淀粉不適合作為餐后高血糖患者的飲食，因此，雖然淀粉能夠提高發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性，還是建議盡量不向起始培養(yǎng)基中加入淀粉。大豆粉和豆渣也能顯著提高發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性，考慮到豆渣的成本較大豆粉低很多，因此本研究中采用豆渣作為Bacillus subtilisB2發(fā)酵唯一營養(yǎng)源進(jìn)行發(fā)酵，并試圖為豆渣的開發(fā)利用開辟一條新途徑。

從圖1可以看出，豆渣質(zhì)量濃度對發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響明顯，隨著豆渣質(zhì)量濃度的增大，發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性也隨之增加。豆渣質(zhì)量濃度從10mg/mL增加到30mg/mL的過程中，發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性從6.9迅速增加到21.8。當(dāng)豆渣質(zhì)量濃度高于30mg/mL時(shí)，繼續(xù)增大豆渣質(zhì)量濃度，發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性增加的速度放緩，最高抑制活性達(dá)到25.6。

圖1 豆渣質(zhì)量濃度對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.1 Effect of soybean dregs concentration on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

以豆渣為唯一營養(yǎng)源，即Bacillus subtilisB2生長的碳源及氮源均來源于豆渣。豆渣中含有24%左右的大豆蛋白可以作為菌體生長的良好氮源，大豆低聚糖、單糖等可以作為碳源[8,11]。同時(shí)，豆渣中含有豐富的纖維素，包括可溶性纖維和不溶性纖維，Bacillus subtilisB2在生長過程中可以水解部分纖維素成低聚糖或單糖，作為生長的碳源。本實(shí)驗(yàn)中改變豆渣的濃度，也就是改變初始發(fā)酵液中碳源及氮源的濃度，這通常會對菌體生長及代謝產(chǎn)生較大的影響[14]。因此，豆渣濃度發(fā)生變化，發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶活性也會發(fā)生改變。

2.2 培養(yǎng)基初始pH值的影響

圖2 pH值對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.2 Effect of medium initial pH on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由圖2可見，培養(yǎng)基初始pH5時(shí)發(fā)酵液的抑制活性僅為1.2，幾乎沒有抑制活性。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH5.5時(shí)，發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，達(dá)到10.4。隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加，發(fā)酵液的抑制作用也增強(qiáng)，當(dāng)初始pH7時(shí)，抑制活性最高達(dá)到22.9。隨著培養(yǎng)基初始pH值進(jìn)一步增加，發(fā)酵液抑制活性又逐漸下降，到pH10時(shí)，抑制活性為7.7。培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)在酸性范圍內(nèi)時(shí)，pH值的變化對抑制活性的影響顯著，在pH值低于5.5的環(huán)境下，最終發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性也較低，這可能是因?yàn)榈蚿H值容易抑制細(xì)菌的生長，進(jìn)而影響其產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶抑制因子的能力。在堿性范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑制活性的變化趨勢相對較緩慢。總的說來，初始pH值在6～8之間，發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性較高，維持在18以上。

2.3 發(fā)酵溫度的影響

圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由圖3可見，40℃發(fā)酵所得發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強(qiáng)，達(dá)到23.4。在30～45℃范圍內(nèi)發(fā)酵液的抑制活性均較高，在14.7以上。但當(dāng)溫度低于30℃及高于45℃時(shí)，發(fā)酵液的抑制活性降低很快，20℃及50℃時(shí)的抑制活性分別是最高抑制活性的31.3%和4.8%。在溫度較低的情況下，菌體生長緩慢，因此當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行48h后發(fā)酵液的抑制活性仍然不高。本研究所用菌種為枯草芽孢桿菌，就菌種本身來說因其具有芽孢，是能夠耐受高溫的，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度增到50℃時(shí)，發(fā)酵液的抑制活性就顯著降低，這可能是因?yàn)椋嚎莶菅挎邨U菌雖然能在高溫環(huán)境下存活，但其正常的生長繁殖能力卻受到高溫條件的影響而降低，另一方面，高溫環(huán)境也可能會改變正常菌株合成α-葡萄糖苷酶抑制因子的能力[15]。

2.4 接種量的影響

圖4 接種量對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.4 Effect of inoculum size on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由圖4可見，當(dāng)接種量大于104個(gè)/mL時(shí)，發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性均在20以上，不同的接種量對抑制活性影響差別不大，當(dāng)接種量為103個(gè)/mL時(shí)，發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性不高，為最高抑制活性的70%，說明接種量103個(gè)/mL太小，一定程度上影響了菌株的生長及α-葡萄糖苷酶抑制因子的生成。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將選擇接種量106個(gè)/mL。

2.5 發(fā)酵時(shí)間的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.5 Effect of fermentation time on theα-glucosidase inhibitory activity of fermentation broth

由圖5可見，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到12h時(shí)，發(fā)酵液具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，抑制活性也增加，發(fā)酵進(jìn)行到48h時(shí)，抑制活性達(dá)到22.8，進(jìn)一步延長發(fā)酵時(shí)間，抑制活性增長速度緩慢。發(fā)酵進(jìn)行到96h時(shí)，抑制活性達(dá)24.3。

3 結(jié) 論

本研究對Bacillus subtilisB2產(chǎn)DNJ的液體發(fā)酵條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明：豆渣濃度、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH值及發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性影響較大。在豆渣質(zhì)量濃度30mg/mL，初始pH6～8，發(fā)酵溫度40℃的條件下發(fā)酵48h，發(fā)酵液表現(xiàn)出較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，即發(fā)酵液中DNJ含量較高。在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，有望通過進(jìn)一步研究得到含穩(wěn)定有效降血糖成分的功能性食品。同時(shí)，將發(fā)酵豆渣開發(fā)成特殊用途的食品，可以大大提高豆渣的利用價(jià)值，為豆渣的開發(fā)利用開辟新途徑。

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Optimization of Fermentation Conditions for 1-Deoxynojimycin (DNJ) Production byBacillus subtilisB2

ZHU Yun-ping1，LI Xiu-ting1，LI Li-te2
(1. School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

TQ920.1

A

1002-6630(2010)17-0290-04

2010-06-09

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD27B09)；北京工商大學(xué)青年啟動基金項(xiàng)目；北京市優(yōu)秀人才項(xiàng)目；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071511)

朱運(yùn)平(1980—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：zhuyp@th.btbu.edu.cn