王 陶,李 文
(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院,江蘇 徐州 221008)
正交法優(yōu)化酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵工藝
王 陶,李 文
(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院,江蘇 徐州 221008)
以麩皮為基本原料,對(duì)黑曲霉TW012產(chǎn)酸性植酸酶的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以提高酸性植酸酶的產(chǎn)量。依據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵的最佳工藝條件為:氮源(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%、pH5.0、含水量70%、30℃發(fā)酵5d,此時(shí)酸性植酸酶的酶活力可達(dá)346.576U/g干基,較優(yōu)化前提高了23.77%。
酸性植酸酶;固態(tài)發(fā)酵;工藝;正交試驗(yàn)
Abstract:The production process of acidic phytase based on the use of wheat bran as fermentation substrate in solid-state fermentation byAspergillus nigerTW012 was optimized using single factor method and orthogonal array design in this study.The optimum fermentation conditions were found to be:ammonium sulfate content in medium 1.6%, medium initial pH 5.0,medium water content 70%, fermentation temperature 30 ℃, and fermentation cycle 5 days. Under these optimum conditions,the maximum acidic phytase activity in the final fermentation product reached up to 346.576 U/g dry matter, 23.77% higher than before optimization.
Key words:acidic phytase;solid-state fermentation;technology;orthogonal array design
植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解為肌醇與磷酸(磷酸鹽)的一類酶的總稱[1]。廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和飼料工業(yè)中[2-5]。它能使植物性飼料中磷的利用率提高60%,糞便中磷的排出量減少40%,從而減少飼料中磷的添加量,降低對(duì)環(huán)境的污染[6];它還可破壞植物性飼料或食品中植酸與礦物元素及蛋白質(zhì)的親和力,提高礦物元素生物利用率和蛋白質(zhì)的消化率,從而提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和畜牧生產(chǎn)效益[7-10]。
植酸酶來源廣泛,包括植物、動(dòng)物和微生物。由于來源于微生物的植酸酶作用范圍和穩(wěn)定性較好,易規(guī)?;a(chǎn),近幾年的研究大都集中在微生物來源植酸酶[11]。根據(jù)最適pH值的不同,植酸酶可分為酸性植酸酶、中性植酸酶和堿性植酸酶[12],而酸性植酸酶,包括有組氨酸酸性植酸酶(H A P)、紫色酸性植酸酶(PAP)、β-螺旋植酸酶(BPP)[13];適用于胃pH值呈酸性的單胃動(dòng)物以及少數(shù)魚類如虹鱒等[14],其酶促反應(yīng)的pH值有效作用范圍在2.5~5.5之間,能有效作用于單胃動(dòng)物的消化道,并對(duì)選擇底物(如植酸) 具有高度特異活性[15]。目前,固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的研究較少,還未見利用正交法優(yōu)化酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵工藝的報(bào)道??紤]到固態(tài)發(fā)酵具有投資少、耗能低、工藝簡(jiǎn)單和無“三廢”等優(yōu)點(diǎn),研究酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵工藝,以提高植酸酶的產(chǎn)量。
酸性植酸酶產(chǎn)生菌黑曲霉TW012由徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。
植酸鈉(相應(yīng)分析純補(bǔ)充純度級(jí)別) Sigma公司;鉬酸銨(分析純) 合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠;三氯乙酸(分析純) 天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。
HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;DL-5低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。
斜面培養(yǎng)基:查氏合成培養(yǎng)基:NaNO33.0 g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、蔗糖30g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL;固體培養(yǎng)基:麩皮100g、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 6 %的(NH4)2SO4溶液165mL,pH 5. 2~5. 5。
將接種后的斜面于28℃培養(yǎng)3d。
250mL錐形瓶裝10g固體培養(yǎng)基,接入3環(huán)斜面活化后的黑曲霉孢子,28℃條件下靜置培養(yǎng)4d。
將100mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的CaCl2溶液加入培養(yǎng)后的錐形瓶中,置于200r/min搖床上振蕩、抽提1h,過濾,取5mL濾液于4000r/min離心5min,得到植酸酶粗酶液。
氮源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響:固定其他條件,考察質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%的硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨、尿素、牛肉膏對(duì)酶活力的影響,確定最佳氮源。
氮源添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響:在最佳氮源的基礎(chǔ)上,考查其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.4%、1.0%、1.6%、2.0%、2.2%時(shí)對(duì)酶活力的影響,確定最佳氮源添加量。
培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響:固定其他條件,考查培養(yǎng)基初始pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0時(shí)對(duì)酶活力的影響,確定最佳培養(yǎng)基初始p H值。
培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響:固定其他條件,考查培養(yǎng)溫度分別為24、26、28、30、32、35℃時(shí)對(duì)酶活力的影響,確定最佳培養(yǎng)溫度。
培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響:固定其他條件,考查培養(yǎng)時(shí)間分別為3、4、5、6、7d對(duì)酶活力的影響,確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。
培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響:固定其他條件,考查培養(yǎng)基含水量分別為60%、66%、70%、73%、77%、80%時(shí)對(duì)酶活力的影響,確定最佳培養(yǎng)基含水量。
以培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間以及培養(yǎng)基含水量4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),確定固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酸性植酸酶的最佳條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1。
表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design
將4.0mmol/L磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液(pH 5.0的乙酸緩沖液配制)用乙酸緩沖液稀釋成濃度為0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/L的溶液,分別吸取0.2mL標(biāo)準(zhǔn)磷溶液,加入0.8mL 6.25mmol/L植酸鈉溶液,37℃保溫30min,加入 1mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng),再加入1mL 硫酸亞鐵鉬酸銨顯色液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%鉬酸銨和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.7%硫酸亞鐵以體積比4:1混合),靜置10min后在波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)空白為先在標(biāo)準(zhǔn)磷溶液中加入1mL 5%的TCA 使酶失活,再加入同體積的底物保溫。以無機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,列出直線回歸方程。
0.2 mL的酶稀釋液加入0.8mL 6.25mmol/L的植酸鈉,37℃保溫30min,加入1mL 5%的 TCA終止酶活反應(yīng),然后加入1mL硫酸亞鐵鉬酸銨顯色液,靜置10min后在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度。對(duì)照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mL 5%的TCA使酶失活,再加入同體積的底物保溫。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。
酶活力單位定義:以37℃、pH5.0條件下,1min從6.25mmol/L植酸鈉溶液中水解釋放lμmol無機(jī)磷所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。
圖1 磷酸二氫鉀溶液濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of K2HPO4
由圖1可知,磷酸氫二鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度之間有良好的線性相關(guān)關(guān)系,回歸方程為y=0.0028x-0.0043,相關(guān)系數(shù)R=0.9989。
表2 氮源種類對(duì)黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響(±s)Table 2 Effect of nitrogen source type on acidic phytase production(±s)
表2 氮源種類對(duì)黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響(±s)Table 2 Effect of nitrogen source type on acidic phytase production(±s)
氮源 空白 硫酸銨 硝酸鈉 硝酸銨 尿素 牛肉膏酶活力/198.330±2.211297.717±1.315251.073±2.406208.484±1.068226.875±1.542282.521±1.672(U/g)
由表2可見,在含氮量相同的條件下,硫酸銨作氮源產(chǎn)酶效果較好。這可能是由于發(fā)酵的固體基質(zhì)麩皮中有一定的含氮量,但無機(jī)氮源較易被菌體利用,使菌體快速生長(zhǎng),以消耗培養(yǎng)基中釋放的無機(jī)磷,解除無機(jī)磷對(duì)植酸酶活力的反饋抑制。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用硫酸銨作氮源。
圖2 培養(yǎng)基的含氮量對(duì)黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.2 Effect of medium nitrogen content on acidic phytase production
由圖2可見,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%時(shí),植酸酶的酶活力最高。氮源添加量過低,無法保證產(chǎn)植酸酶所需的氮元素,菌體生長(zhǎng)受限,產(chǎn)酶受影響;氮源添加量過高,反而導(dǎo)致不適的碳氮比,會(huì)抑制酶的活性,因此,氮源添加量控制在1.6%。
圖3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.3 Effect of medium initial pH on acidic phytase production
由圖3可知,產(chǎn)酶的最適初始pH值約為5.0,處于酸性植酸酶的有效作用范圍(2.5~5.5)之間,這也與此酶是酸性植酸酶是相一致的。
圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on acidic phytase production
溫度通過影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性以及生物大分子的活性來影響微生物的生物活性。由圖4可見,隨著培養(yǎng)溫度的升高,所產(chǎn)植酸酶的酶活力也隨之升高,但是溫度過高,菌體生長(zhǎng)受影響,會(huì)導(dǎo)致所產(chǎn)酶的酶活力下降,在30℃時(shí),酶活力最高。
圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.5 Effect of fermentation time on acidic phytase production
由圖5可見,發(fā)酵前期,主要是菌體細(xì)胞在生長(zhǎng),到了發(fā)酵的后期,主要是產(chǎn)酶,發(fā)酵終止時(shí)間應(yīng)在酶活力最高時(shí)??紤]到前期主要是細(xì)胞生長(zhǎng),從發(fā)酵第3天開始測(cè)定酸性植酸酶的酶活力,直到第7天結(jié)束,其規(guī)律顯示在第5天時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶最高峰。
由于麩皮的含水量不能滿足黑曲霉TW012的生長(zhǎng)需求,因此需要附加水分,培養(yǎng)基的含水量為60%、66%、70%、73%、77%、80%時(shí),酶活力變化如圖6所示。
圖6 培養(yǎng)基含水量對(duì)黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.6 Effect of medium moisture content on acidic phytase production Table3 Orthogonal array layout and experimental results
由圖6可見,隨著培養(yǎng)基含水量的增加,酶活力先提高后下降,這可能是由于培養(yǎng)基含水量過低不利于菌體細(xì)胞的生長(zhǎng),含水量過高一方面會(huì)導(dǎo)致空氣中氧分壓降低,另一方面導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)部溶氧不足,影響菌體細(xì)胞的透氣性,也不利于菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。所以培養(yǎng)基含水量控制在66%左右為宜。
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,為考查各因素之間的交互作用,選擇不同pH值、溫度、培養(yǎng)時(shí)間以及培養(yǎng)基含水量為影響因素,選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn),因素水平如表2所示,結(jié)果見表3。
表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Orthogonal array layout and experimental results
由表3可知,各因素對(duì)酸性植酸酶活性的影響次序?yàn)镃>A>D>B,即培養(yǎng)時(shí)間>pH值>培養(yǎng)基含水量>溫度,其最優(yōu)方案為A1B2C2D3,即培養(yǎng)基的pH值為5.0、溫度為30℃、含水量為70%的條件下發(fā)酵5d。
將正交試驗(yàn)優(yōu)選組合A1B2C2D3和試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)組合A1B2C2D2分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn),平行3次,結(jié)果為:A1B2C2D3的植酸酶平均酶活力為346.576U/g,A1B2C2D2的酶活力為336.32U/g。差異顯著性分析結(jié)果表明,兩種組合的酶活力在α=0.05水平有顯著性差異。因此,正交優(yōu)選組合為較優(yōu)工藝,即最優(yōu)的發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)基含水量為70%的條件下發(fā)酵5d。
圖7 黑曲霉TW012固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)植酸酶曲線Fig.7 Tim-course curve of acidic phytase production
在最佳發(fā)酵條件下,黑曲霉TW012產(chǎn)酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵的進(jìn)程見圖7,隨著時(shí)間的推移,酶活逐漸增大,培養(yǎng)5d時(shí),所產(chǎn)植酸酶的酶活力最高,為346.576 U/g,較優(yōu)化前提高了23.77%,以后酶活力略有下降,有可能是隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),培養(yǎng)基的條件越來越不適合產(chǎn)酶。
通過單因素及正交試驗(yàn)確定黑曲霉TW012產(chǎn)酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵的最適宜條件為:以麩皮為基質(zhì),氮源(NH4)2SO4添加量1.6%,培養(yǎng)基pH5.0,含水量70%,溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間5 d。最優(yōu)條件下,酶活力達(dá)346.576U/g。
麩皮作為一種廉價(jià)的資源,被廣泛應(yīng)用于飼料和養(yǎng)殖業(yè)中,利用黑曲霉TW012固態(tài)發(fā)酵此類物質(zhì)生產(chǎn)酸性植酸酶工藝簡(jiǎn)單、成本低;同時(shí)可以釋放其中的磷,減少對(duì)環(huán)境的污染,具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過發(fā)酵條件優(yōu)化,黑曲霉TW012固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酸性植酸酶的酶活力較優(yōu)化前提高了23.77%。
[1] 趙翠燕, 許欽坤, 柯野. 植酸酶的來源及合成研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)飼料,2009(8):11-12.
[2] PEERS F G. The Phytase of Wheat[J]. Biochem J,1953, 53(1):102-110.
[3] 李路勝, 馮定遠(yuǎn). 生物技術(shù)生產(chǎn)飼料添加劑植酸酶[J]. 飼料廣角, 2003(11):27-28.
[4] MAGA J A. Phytate:its chemistry, occurrence, food interactions, nutritional significance, and methods of analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1982, 30:1-9.
[5] 陳惠, 王紅寧, 吳崎. 飼用植酸酶蛋白質(zhì)工程研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2004, 31(3):106-110.
[6] NELSON T S. The utilization of phytate phosphorus by poultry[J].Poult Sci, 1967, 46:862-871.
[7] SHARMA C B , GOEL M, IRSHAD M. Myoinositol hexaphosphate as a potential inhibitor ofα-amylases [J]. Phytochemistry, 1978, 17(2):201-204.
[8] 施安輝, 王光玉, 李桂杰. 目前國(guó)內(nèi)外植酸酶研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)釀造,2005(5):5-10.
[9] 李大剛, 張秉勝, 張廣民. 植酸酶及其生產(chǎn)概述[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2003(1):8-9.
[10] WYSS M, PASAMONTES L. Biophysical characterization of fungal phytases(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases):molecular size, glycosylation pattern, and engineering of proteolyticresistance[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65:359-366.
[11] 趙翠燕, 許欽坤, 柯野. 植酸酶的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2009(2):18-19.
[12] 曾繼蛟, 李英倫, 王鴻賓. 黑曲霉變異株A-828 酸性植酸酶的生物合成和性質(zhì)的研究[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2009, 28(3):428-434.
[13] MULLANEY E J, ULLAH A H J. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 312(1):179-184.
[14] 王亞茹, 姚斌, 曾虹, 等. 枯草芽孢桿菌中性植酸酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2001, 41(2):198-203.
[15] 朱海東, 周曉蕓, 王蓓. 植酸酶的研究進(jìn)展[J]. 飼料研究, 2005(1):13-15.
Orthogonal Array Optimization of Acidic Phytase Production by Solid-state Fermentation
WANG Tao,LI Wen
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)
S816.7;Q933
A
1002-6630(2010)17-0286-04
2010-06-16
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10605027);徐州工程學(xué)院青年課題(XKY2009122)
王陶(1976—),男,講師,博士,研究方向?yàn)殡x子束生物工程學(xué)和資源微生物學(xué)。E-mail:wangtaohf@126.com