不同來源釀酒酵母對(duì)柑橘果酒香氣成分的影響

李 銳，馮 奎，吳 婧，范 剛，潘思軼，徐曉云*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

不同來源釀酒酵母對(duì)柑橘果酒香氣成分的影響

李 銳，馮 奎，吳 婧，范 剛，潘思軼，徐曉云*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

研究不同來源釀酒酵母對(duì)柑橘果酒香氣成分的影響，以錦橙表皮和柑橘園土壤為酵母的來源，經(jīng)培養(yǎng)、分離、純化、初篩和復(fù)篩得到適于柑橘果酒釀造的酵母菌株。確定其最適生長(zhǎng)溫度、pH值及對(duì)乙醇和SO2的耐受性，并用GC-MS分析其對(duì)柑橘果酒香氣的影響。結(jié)果顯示：篩選得到3株酵母菌L3、L5、L9，其最適生長(zhǎng)溫度為28～30℃，最適pH值在3.5左右，其中L3耐低溫和高溫的能力最強(qiáng)，L9乙醇耐受力最強(qiáng)，L5對(duì)SO2的耐受能力最強(qiáng)。3株酵母所釀柑橘果酒的香氣成分有特異性差異，庚酸乙酯、萜品油烯等13種物質(zhì)為L(zhǎng)3酵母菌所釀柑橘果酒獨(dú)有；月桂醇、乙酸異丁酯等8種物質(zhì)僅見于L5酵母菌所釀柑橘果酒中；正辛醇、5-甲基呋喃醛等4種物質(zhì)只在L9酵母菌所釀柑橘果酒中存在。

釀酒酵母；柑橘果酒；篩選；固相微萃??；香氣組分

Abstract：In order to explore the effects ofSaccharomyces cerevisiaestrains from different sources on the aromatic composition of orange wine, several strains ofSaccharomyces cerevisiaesuitable for brewing orange wine were obtained from decayed Jincheng orange (Citrus sinensisOsbeck cv. Jincheng) peel and orange orchard soil after cultivation, separation, purification, preliminary screening and secondary screening. The optimal growth temperature, pH and resistance to ethanol and sulfur dioxide of these yeast strains were investigated and the aroma composition of orange wine fermented by each of them was determined by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The screened yeast strains L3, L5 and L9 exhibited an optimal growth temperature ranging from 28 to 30 ℃ and an optimal pH of around 3.5. In addition, they had the strongest resistance to abnormal temperatures, sulfur dioxide and alcohol, respectively. Moreover, an obvious difference in aromatic composition was observed among orange wines fermented by these three yeast strains. Ethyl oenanthate, terpinolene, and 13 kinds of other aromatic components were unique in orange wine fermented by yeast strain L3. Dodecyl alcohol, isobutyl acetate and 8 kinds of other aromatic components were special for orange wine fermented by yeast strain L5 and octanol, 5-methyl furfural and 4 kinds of other aromatic components for wine from yeast strain L9.

Key words：Saccharomyces cerevisiae；orange wine；screening；SPME (solid phase microextraction)；aroma component

柑橘是世界上產(chǎn)量最大的水果，我國(guó)目前的柑橘產(chǎn)量居世界第二，有著豐富的柑橘品種和資源，然而我國(guó)柑橘加工業(yè)還十分薄弱[1]。柑橘果酒是國(guó)內(nèi)一種新興的柑橘深加工產(chǎn)品，可提高柑橘的附加值。而香氣是評(píng)價(jià)柑橘果實(shí)及其加工產(chǎn)品內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)，香氣的好壞直接影響著柑橘果酒的風(fēng)味品質(zhì)和消費(fèi)者的選購(gòu)心理。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)柑橘果酒的研究多集中在釀造工藝及選育適宜釀酒的酵母方面，如潘訓(xùn)海等[2]用正交試驗(yàn)方法研究，在發(fā)酵溫度控制為24℃，果膠酶用量為0.7g/100mL，SO2用量為70mg/L，酵母接種量為0.7g/L的條件下釀得的柑橘果酒品質(zhì)較好；陳茂彬等[3]從柑橘自然發(fā)酵液中分離，并通過初篩及發(fā)酵瓶復(fù)篩，選育出一株在柑橘汁中發(fā)酵能力強(qiáng)，產(chǎn)酒度較高，殘?zhí)禽^低，產(chǎn)香較好，完全可以作為獨(dú)立的發(fā)酵菌株使用的酵母菌G-17。但國(guó)內(nèi)外對(duì)柑橘果酒香氣組分進(jìn)行比較研究的相關(guān)報(bào)道還較少，Selli等[4-6]對(duì)土耳其柑橘品種和Moro Orange釀造的果酒中的香氣組分進(jìn)行過研究，Mingorance-Cazorla等[7]研究了不同種自然選育酵母對(duì)兩種酒精飲料香氣組分的影響。

本實(shí)驗(yàn)在總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上，以錦橙表皮和柑橘園土壤為酵母的來源，從其中分離并篩選出適宜柑橘果酒釀造的酵母菌株，并重點(diǎn)研究柑橘果酒的香氣組成及不同釀酒酵母對(duì)柑橘果酒香氣成分的影響。初步探討適合釀造柑橘果酒的酵母菌的釀造特性及其對(duì)柑橘果酒品質(zhì)的影響，旨在為進(jìn)一步深入研究柑橘果酒釀造工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

錦橙及土壤采自湖北松滋望春花果汁有限公司柑橘園。錦橙又名鵝蛋柑26號(hào)，四川、重慶各柑橘產(chǎn)區(qū)幾乎都有分布，湖北、貴州、福建也有一定數(shù)量的栽培。本實(shí)驗(yàn)用錦橙樣品的可溶性固形物為11°Brix，總酸為1.07%，pH值為3.76，固酸比為10.28，出汁率為42.72%。

1.2 試劑

偏重亞硫酸鈉 天津市河北區(qū)海晶精細(xì)化工廠；甲醇、乙醇 上海振興化工廠；氫氧化鈉 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；硫酸 信陽淮河化學(xué)試劑有限公司；蒽酮 北京化學(xué)試劑三廠；鹽酸-副玫瑰苯胺 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉 上海試回赫維化工廠。

1.3 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；生化培養(yǎng)箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；752型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司； 6890N-5975B型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀 安捷倫公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器 Supelco公司。

1.4 培養(yǎng)基

分離、活化用培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：土豆200g，加水1000mL，煮至土豆酥而不爛，紗布過濾取上清液，加蔗糖20g/L、瓊脂20g/L，煮溶后分裝入三角瓶中，0.1MPa蒸汽滅菌30min備用。

擴(kuò)大培養(yǎng)用培養(yǎng)基(麥芽汁培養(yǎng)基)：由湖北省啤酒學(xué)校提供，4層細(xì)紗布過濾取上清液，加蒸餾水調(diào)糖度為10°Brix[8]，pH值自然，0.1MPa蒸汽滅菌30min備用。

完全培養(yǎng)基(g/100mL)：蔗糖2、酵母膏1、蛋白胨1、瓊脂2，0.1MPa蒸汽滅菌30min備用。

1.5 方法

1.5.1 酵母菌的培養(yǎng)與篩選

1.5.1.1 酵母菌的分離

配制0.9%的生理鹽水適量，分裝入三角瓶A、B和8支試管中，每個(gè)三角瓶裝99mL，每只試管中裝9mL。在A三角瓶中加入1g腐爛的錦橙表皮，在B三角瓶中加入1g柑橘果園土壤，搖勻。8支試管每4支為一組，分別從A、B兩瓶溶液中取1mL加入到其中一支試管中，然后依次從前一支試管取1mL溶液加入后一支試管，這樣A、B兩種都得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-65個(gè)質(zhì)量濃度梯度。在無菌條件下倒平皿10個(gè)，待培養(yǎng)基冷卻到適宜溫度后，取上述5個(gè)梯度的溶液各1mL，加入PDA培養(yǎng)基中搖勻，做標(biāo)記，冷卻后在28℃恒溫箱中倒立培養(yǎng)5～7d，觀察。

1.5.1.2 酵母菌的純化

準(zhǔn)備若干PDA培養(yǎng)基平板，挑選出10個(gè)平皿中有酵母菌單菌落的平板。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小和在顯微鏡下觀察的單菌形態(tài)的不同，挑取不同的菌落在無菌條件下劃線，28℃恒溫箱中倒立培養(yǎng)5～7d，觀察。

同上述方法，每種菌劃線培養(yǎng)4～5代，最后即可得到純化的酵母品種，共得到L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14酵母菌，接種入試管，放在4℃冰箱中保存[9]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在4℃條件下菌種依然處在生長(zhǎng)狀態(tài)，所以依實(shí)驗(yàn)室條件改為－4℃冰箱中保存。

1.5.1.3 酵母菌種的活化

準(zhǔn)備PDA培養(yǎng)基平板，在無菌條件下取酵母菌種劃線，28℃恒溫箱中倒立培養(yǎng)12～24h，此時(shí)酵母菌正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[10]。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)24h內(nèi)，酵母菌無法長(zhǎng)成可見的單菌落，所以培養(yǎng)時(shí)間為2～3d，可能原因是野生酵母菌沒有經(jīng)過人工馴化培養(yǎng)，生長(zhǎng)比較緩慢。

1.5.1.4 酵母菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

取麥芽汁培養(yǎng)基適量，分裝入三角瓶中，每瓶裝20mL，0.1MPa滅菌30min，冷卻到常溫后在無菌條件下每瓶接入一種酵母菌2滿環(huán)，28℃、160r/min搖床中培養(yǎng)24h。

1.5.1.5 酵母菌初篩

榨橙汁適量，調(diào)糖度為20°Brix，pH值自然。準(zhǔn)備帶膠塞試管若干，編號(hào)，稱質(zhì)量。將橙汁分裝入試管中，每管約20mL，0.1MPa滅菌30min。無菌條件下，挑取活化酵母菌單菌落，每管接入兩環(huán)，接入酵母菌株編號(hào)與管號(hào)對(duì)應(yīng)，然后再次稱質(zhì)量。放在28℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔24h觀察發(fā)酵產(chǎn)氣(可輕輕搖晃)情況，稱質(zhì)量，直到兩次稱得質(zhì)量之差小于0.2g為發(fā)酵終點(diǎn)[11]，比較其發(fā)酵力(CO2失質(zhì)量法)。需要3～7d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)其產(chǎn)乙醇能力。

1.5.1.6 酵母菌復(fù)篩

榨橙汁適量，調(diào)糖度為20°Brix，pH值自然，加偏重亞硫酸鈉50mg/L[8]，然后分裝入三角瓶中，每瓶約200mL，取擴(kuò)大培養(yǎng)的酵母菌懸液按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接入三角瓶[12]，每種酵母菌接種3瓶做平行，28℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔7d測(cè)定一次殘?zhí)橇?、可溶性固形物含量和乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.5.2 柑橘果酒釀造工藝[2,13]

榨橙汁適量，加入果膠酶5g/L，過夜后虹吸得清液，調(diào)糖度為20°Brix，加偏重亞硫酸鈉50mg/L，分裝入發(fā)酵罐后0.1MPa滅菌30min。按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接入擴(kuò)大培養(yǎng)的酵母菌懸液，24～26℃主發(fā)酵，保持通氣，觀察到無氣泡后表示主發(fā)酵完成，密封進(jìn)行后發(fā)酵15～20d。倒桶，22～24℃陳釀。

1.5.3 果酒理化指標(biāo)的測(cè)定

總糖采用蒽酮法測(cè)定；二氧化硫殘留量采用鹽酸-副玫瑰苯胺法；總酸采用酸堿滴定法；pH值采用酸度計(jì)測(cè)定；可溶性固形物采用手持糖度計(jì)測(cè)定；乙醇采用GC方法測(cè)定。

1.5.4 GC分析

果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)采用GC分析的方法。氣相色譜條件：毛細(xì)管柱為HP-5(30m×320μm，0.25μm)，程序升溫，起始溫度45℃，保持5min，以5℃/min 升至50℃，保持3min，再以30℃/min 升至230℃，保持1min，進(jìn)樣量1.0μL，進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器溫度(FID)280℃。

1.5.5 果酒中香氣物質(zhì)的分析[14-15]

1.5.5.1 果酒中香氣物質(zhì)的提取

取果酒10mL移入20mL鉗口樣品瓶中，加入3.6g NaCl，促進(jìn)揮發(fā)性成分的揮發(fā)，加入10μL環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)物(0.946mg/mL乙醇)，用聚四氟乙烯隔墊密封，于磁力攪拌器上在40℃加熱平衡15min后，通過隔墊插入已活化好的萃取頭(270℃活化30 min)，推出纖維頭，頂空吸附40min后，插入GC進(jìn)樣口解析5min。

1.5.5.2 香氣成分的GC-MS分析

采用Agilent 6890N-5975 inert 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30m×320μm，0.25μm)，程序升溫同GC。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70eV，燈絲發(fā)熱電流0.25mA，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度250℃，掃描速度全程(50～550)u/s。

1.5.5.3 香氣組分的定性定量分析

定性采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST05/WILEY7.0)進(jìn)行初步檢索及資料分析，再進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)各種組分。

定量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)物。計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

表1 產(chǎn)氣性測(cè)定Table 1 Observation of gas-producing capacity

根據(jù)表1的結(jié)果，并結(jié)合起酵時(shí)間、發(fā)酵速度和減重速度，初步篩選出發(fā)酵能力較強(qiáng)的L1、L3、L5、L7、L8和L9共6株酵母菌。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

圖1 復(fù)篩各酵母菌種理化指標(biāo)Fig.1 Physical and chemical indexes of yeast strains after secondary screening

由圖1可知，6種酵母菌，15d內(nèi)兩次測(cè)定的各項(xiàng)理化指標(biāo)，其差值越大，說明該種酵母菌的發(fā)酵能力越強(qiáng)。綜合總糖差值、可溶性固形物含量差值與產(chǎn)乙醇體積分?jǐn)?shù)差值，復(fù)篩出L3、L5和L9作為柑橘果酒發(fā)酵酵母菌株。

2.3 選育酵母菌的性質(zhì)研究[3,9,16]

2.3.1 選育酵母菌最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定

將擴(kuò)大培養(yǎng)的3種酵母菌接入液態(tài)完全培養(yǎng)基中，放在24、26、28、30、32℃恒溫培養(yǎng)10h，在660nm波長(zhǎng)處測(cè)其OD值，確定各自的最適生長(zhǎng)溫度。

圖2 3種酵母菌最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定Fig.2 Determination of optimal growth temperature for three yeast strains

由圖2可知，L3和L9的最適生長(zhǎng)溫度為28℃，L5的最適生長(zhǎng)溫度為30℃。

2.3.2 選育酵母菌最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定

液態(tài)完全培養(yǎng)基，加入檸檬酸和NaOH調(diào)整pH值分別為3、3.5、4、4.5，接入經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)的3種酵母菌，28℃恒溫箱中培養(yǎng)10h，660nm波長(zhǎng)處測(cè)其OD值，確定各自的最適生長(zhǎng)pH值。

圖3 3種酵母菌最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定Fig.3 Determination of optimal growth pH for three yeast strains

由圖3可以看出， L3在pH值為3.5～4.5間生長(zhǎng)良好，L5最適生長(zhǎng)pH值為3.5～4，L9最適生長(zhǎng)pH值為3～3.5。

2.3.3 選育酵母菌對(duì)高、低溫耐受性的測(cè)定

取完全培養(yǎng)基倒平板，接種入0.1mL擴(kuò)大培養(yǎng)的酵母菌懸液，涂布平板。分別放入2、4、8、30、37、40℃條件下培養(yǎng)5～7d，觀察3種酵母菌的生長(zhǎng)情況，確定對(duì)高、低溫耐受性。

表2 3種酵母菌對(duì)高、低溫的耐受性測(cè)定Table 2 Determination of temperature resistance for three yeast strains

由表2可知，L3的最低生長(zhǎng)溫度為2℃，最高生長(zhǎng)溫度為 40℃，能適應(yīng)的生長(zhǎng)溫度范圍寬；L5的最低生長(zhǎng)溫度為8℃，但生長(zhǎng)的不好，最高生長(zhǎng)溫度為40℃；L9的最低生長(zhǎng)溫度為4℃，最高生長(zhǎng)溫度為40℃。

2.3.4 選育酵母菌對(duì)乙醇耐受力的測(cè)定

液態(tài)完全培養(yǎng)基，加入95%乙醇，調(diào)整乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為12%、14%、18%、22%，接入經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的3種酵母菌菌懸液，28℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7d，660nm波長(zhǎng)處測(cè)其OD值，確定各自對(duì)乙醇耐受力。

圖4 3種酵母菌對(duì)酒精耐受力的測(cè)定Fig.4 Determination of alcohol resistance for three yeast strains

由圖4可以看出，L3耐受的乙醇體積分?jǐn)?shù)最大為18%，L5的最大耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%，L9在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到22%時(shí)還能生長(zhǎng)。

2.3.5 選育酵母菌對(duì)SO2耐受力的測(cè)定

液態(tài)完全培養(yǎng)基，加入偏重亞硫酸鈉，調(diào)整質(zhì)量濃度分別為80、100、120、140mg/L，接入經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的3種酵母菌菌懸液，28℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7d，660nm波長(zhǎng)處測(cè)其OD值，確定各自對(duì)SO2的耐受力。

圖5 3種酵母菌對(duì)SO2耐受力的測(cè)定Fig.5 Determination of sulfur dioxide resistance for three yeast strains

由圖5可以看出，L3和L9的偏重亞硫酸鈉耐受力不大于80mg/L，L5的偏重亞硫酸鈉耐受力達(dá)到120mg/L。

2.4 理化指標(biāo)的分析

2.4.1 3種酵母菌釀得柑橘果酒各項(xiàng)理化指標(biāo)

表3 3種酵母菌釀得柑橘果酒的各項(xiàng)理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical indexes of orange wines fermented by three yeast strains

2.4.2 3種酵母菌釀得柑橘果酒及橙汁的香氣組分

表4 3種酵母釀得柑橘果酒及橙汁的香氣組分Table 4 Aroma composition of orange juice and orange wines fermented by three yeast strains

續(xù)表4

圖6 釀酒前橙汁香氣組分的離子流圖Fig.6 Total ion current chromatogram of the aromatic compounds in orange juice

圖7 酵母菌L3釀得柑橘果酒陳釀后的香氣組分的離子流圖Fig.7 Total ion current chromatogram of the aromatic compounds in orange wine fermented by yeast strain L3

圖8 酵母菌L5釀得柑橘果酒陳釀后的香氣組分離子流圖Fig.8 Total ion current chromatogram of the aromatic compounds in orange wine fermented by yeast strain L5

圖9 酵母菌L9釀得柑橘果酒陳釀后的香氣組分離子流圖Fig.9 Total ion current chromatogram of the aromatic compounds in orange wine fermented by yeast strain L9

由表4和圖5可知，釀酒用橙汁中共檢出香氣組分27種，分別是：乙酸乙酯、正乙醛、2-乙烯醛、乙酸異戊酯、4-萜烯醇、α-松油醇、乙酸苯乙酯、糠醇、壬醛、1,4-桉葉素、苯乙醛、癸醛、對(duì)聚傘花素-8-醇、右旋香芹酮、左旋香芹酮、紫蘇醛、R-(+)-2-甲基-1-苯基-1-丙醇、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、4-甲氧基芐醇、3,5-二甲氧基苯乙酮、2',4',5'-三羥基苯丁酮、大馬酮、3-羥基己酸乙酯、芳樟醇、2-乙基己醇、D-檸檬烯、異佛爾酮。但丁酸乙酯、巴倫西亞桔烯、4-松油醇、己醇、β-月桂烯、香芹酮、己酸乙酯等這些被認(rèn)為在錦橙汁中含量比較高的香氣組分[14-15,17]在本次實(shí)驗(yàn)中沒有被檢出，可能的原因之一是高溫高壓蒸汽滅菌對(duì)橙汁中的這些物質(zhì)產(chǎn)生了影響。

發(fā)酵完成時(shí)，3種酵母菌釀得的柑橘原酒中香氣組分共測(cè)得28種，其中有酯類物質(zhì)8種，醇類物質(zhì)10種，酮類物質(zhì)4種，烯類物質(zhì)3種，還有酚類、醛類、咪唑類物質(zhì)各1種。3種酒中都含有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、D-檸檬烯、苯乙醇、3-羥基己酸乙酯、苯甲酸乙酯、4-萜烯醇、α-松油醇、癸醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、大馬酮等物質(zhì)。但這些共有的香氣物質(zhì)中，各種物質(zhì)在3種酒中的含量差別比較大，普遍存在1.5～3倍的差距。Selli等[4]曾指出乙酸乙酯、苯乙醇是柑橘果酒的特征香氣物質(zhì)，這兩種物質(zhì)在3種柑橘酒中含量都比較高，其中L5釀的柑橘酒中含乙酸乙酯的量最高，分別是L3和L9的1.5倍和3倍；苯乙醇的含量在L9釀的柑橘酒中最多，是另兩種酒的2.5倍之多。但乙酸糠酯、2-乙基己醇、正辛醇、乙酸芳樟酯、2,4,5-三甲基噻唑、2-甲氧基苯乙酮、1-壬醇、2-羥基-5-甲基苯乙酮這幾種物質(zhì)只在L3釀得的柑橘果酒中存在，月桂烯只在L5中存在，糠醇、β-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、莰烯只存在于L9中，芳樟醇、5-甲基-3-己烯-2-酮在L3和L5中存在，而L9中不含有。這說明經(jīng)過發(fā)酵釀造，3種酵母釀造的果酒都擁有柑橘果酒主體的特征香氣組分(13種物質(zhì)共有)，但也有各自獨(dú)有的香氣組分，存在特異性差異。

3種酵母菌釀得的柑橘果酒經(jīng)陳釀后共檢出香氣組分44種，分別是：乙酸乙酯、丁酸辛酯、1-戊醇、3-甲基-1,5-戊二醇、2-甲基-1-丁醇、乙酸異丁酯、2-已烯醛、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、2-甲基-1,5-環(huán)己二烯、α-側(cè)柏烯、苯甲醛、5-甲基呋喃醛、雙戊烯、1,4-戊二烯、2-乙基己醇、D-檸檬烯、庚酸乙酯、正辛醇、2-十六醇、月桂醇、3-羥基己酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、丁二酸二乙酯、(Z)-2-甲基丙酸-3-己烯酯、萜品油烯、4-甲基苯甲醇、苯甲酸乙酯、鄰羧基苯甲醛、苯甲酸、4-萜烯醇、α,α-4-三甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醇、α-松油醇、乙酸蘇合香酯、鄰甲基芐醇、癸醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸苯乙酯、丙酸苯乙酯、2-苯乙基酯、甲酸-2-苯乙酯、2,4-二叔丁基苯酚。Selli等[5]還發(fā)現(xiàn)異戊醇、2-苯乙醇、己酸乙酯、芳香醇、香茅醇、萜品烯、丁子香酚等是一種土耳其柑橘品種(Kozan)釀造的果酒中的主要香氣組分。這些物質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)中都沒有發(fā)現(xiàn)，可能可以說明原料品種、酵母以及釀造工藝的不同，得到的柑橘果酒中香氣組分存在著比較大的差別，也有Fan等[18]曾研究自然發(fā)酵與接種發(fā)酵釀的果酒的香氣成分沒有顯著性差異，對(duì)此有待進(jìn)一步研究。

與釀酒用橙汁相比，糠醇、壬醛、正己醛、1,4-桉葉素、苯乙醛、癸醛、對(duì)聚傘花素-8-醇、右旋香芹酮、左旋香芹酮、紫蘇醛、R-(+)-2-甲基-1-苯基-1-丙醇、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、4-甲氧基芐醇、3,5-二甲氧基苯乙酮、2',4',5'-三羥基苯丁酮這15種物質(zhì)只在橙汁中含有。僅有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、4-萜烯醇、α-松油醇、乙酸苯乙酯這5種香氣物質(zhì)在橙汁和3種酵母釀得的陳釀酒中都存在。但乙酸乙酯、乙酸異戊酯、4-萜烯醇3種物質(zhì)在酒中的含量明顯要多于在橙汁中的，α-松油醇、乙酸苯乙酯在橙汁和酒中的含量相差不大。檢出的全部60種香氣物質(zhì)中，除去這20種物質(zhì)，余下的40種物質(zhì)都是經(jīng)過發(fā)酵、釀造和陳釀產(chǎn)生的，充分說明柑橘果酒有區(qū)別于橙汁的獨(dú)特風(fēng)味。

與發(fā)酵完成時(shí)的柑橘果酒相比，陳釀后3種酒共增加香氣物質(zhì)16種。其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、2-乙基己醇、D-檸檬烯、正辛醇、3-羥基己酸乙酯、芳樟醇、α-松油醇、苯乙醇、苯甲酸乙酯、4-萜烯醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯這13種物質(zhì)在發(fā)酵完成和經(jīng)過陳釀的柑橘果酒中都存在。但也有糠醇、5-甲基-3-己烯-2-酮、乙酸糠酯、月桂烯、乙酸芳樟酯、2,4,5-三甲基噻唑、β-松油醇、1-壬醇、2'-甲氧基苯乙酮、癸醛、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、莰烯、2-羥基-5-甲基苯乙酮、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、大馬酮這15種物質(zhì)經(jīng)過陳釀的理化作用消失了。新增了丁酸辛酯、1-戊醇、3-甲基-1,5-戊二醇、2-甲基-1-丁醇、乙酸異丁酯、2-已烯醛、異戊酸乙酯、2-甲基-1,5-環(huán)己二烯、α-側(cè)柏烯、苯甲醛、5-甲基呋喃醛、雙戊烯、1,4-戊二烯、庚酸乙酯、2-十六醇、月桂醇、丁二酸二乙酯、(Z)-2-甲基丙酸-3-己烯酯、萜品油烯、4-甲基苯甲醇、鄰羧基苯甲醛、苯甲酸、α,α-4-三甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醇、乙酸蘇合香酯、鄰甲基芐醇、苯乙酸苯乙酯、丙酸苯乙酯、2-苯乙基酯、甲酸-2-苯乙酯、2,4-二叔丁基苯酚等30種物質(zhì)?？傆?jì)，經(jīng)過陳釀，3種柑橘果酒中香氣物質(zhì)共變化了45種。目前公認(rèn)為果酒在陳釀過程中主要發(fā)生酯化作用、氧化還原及沉淀作用，陳釀促使醇和酸酯化形成各種有芳香氣味的酯類等物質(zhì)，促使單寧、色素等經(jīng)氧化而沉淀，醋酸和醛類經(jīng)氧化而減少，糖苷在酸性溶液中逐漸結(jié)晶下沉，以及有機(jī)酸鹽、果屑細(xì)小微粒等的下沉，從而減少新酒的刺激性、辛辣性及渾濁感，使酒體綿軟適口，醇厚香濃，口味比較協(xié)調(diào)，形成果酒特有的風(fēng)味。上述香氣物質(zhì)的變化進(jìn)一步說明陳釀對(duì)形成柑橘果酒特征香氣物質(zhì)和風(fēng)味有很大貢獻(xiàn)。

陳釀后3種柑橘酒互相比較，只有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、4-萜烯醇、α-松油醇、乙酸苯乙酯、苯甲醛、苯乙醇、乙酸蘇合香酯、苯甲酸乙酯、甲酸-2-苯乙酯、苯乙酸乙酯這11種物質(zhì)是3種酒中共有的組分，有學(xué)者指出：α-松油醇有松木和丁香類香氣，苯乙醇具玫瑰香氣[19]。其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、4-萜烯醇、α-松油醇、乙酸苯乙酯、苯乙醇、乙酸蘇合香酯等含量都比較高，超過100μg/L，它們可能構(gòu)成了柑橘果酒最基本的風(fēng)味組分。3-甲基-1,5-戊二醇、2-已烯醛、α-側(cè)柏烯、雙戊烯、1,4-戊二烯、2-乙基己醇、庚酸乙酯、萜品油烯、3-羥基己酸乙酯、2-十六醇、(Z)-2-甲基丙酸-3-己烯酯、4-甲基苯甲醇、2,4-二叔丁基苯酚這13種物質(zhì)只在L3酵母菌釀得的柑橘果酒中存在，其中3-羥基己酸乙酯的含量高達(dá)670μg/L，3-甲基-1,5-戊二醇、2，4-二叔丁基苯酚的含量也都高于150μg/L。2-甲基-1-丁醇、乙酸異丁酯、月桂醇、鄰羧基苯甲醛、α,α-4-三甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醇、苯乙酸苯乙酯、2-苯乙基酯、丙酸苯乙酯這8種物質(zhì)只在L5酵母菌釀得的柑橘果酒中存在，2-甲基-1-丁醇的含量達(dá)519μg/L，乙酸異丁酯的含量達(dá)628μg/L。正辛醇、2-甲基-1,5-環(huán)己二烯、5-甲基呋喃醛、鄰甲基芐醇這4種物質(zhì)只在L9酵母菌釀得的柑橘果酒中存在，芳樟醇只在L3和L5中含有，芳樟醇有強(qiáng)烈的鈴蘭香氣，并有木香香調(diào)。1-戊醇、異戊酸乙酯、丁二酸二乙酯只在L3和L9中含有，D-檸檬烯、丁酸辛酯、苯甲酸只在L5和L9中含有，其中D-檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣[19]。雖然這些物質(zhì)含量均比較少(大多數(shù)在100μg/L以下)，但相互之間普遍相差較大。正是這些香氣成分在3種酒中含量的不同以及微妙的量比關(guān)系，修飾形成了3種果酒各自獨(dú)特的香氣。而且可以說經(jīng)過陳釀3種酵母釀造的果酒的香氣成分的特異性差異進(jìn)一步加大。

3 結(jié) 論

本研究通過對(duì)柑橘表皮及果園土壤中酵母菌株的篩選，得到3種適宜釀造柑橘果酒的酵母，并對(duì)其釀造特性進(jìn)行了研究，它們的最適生長(zhǎng)溫度在28～30℃，最適pH值在3.5左右，其中L3的耐低溫和高溫的能力最強(qiáng)，L9耐酒精體積分?jǐn)?shù)最高，L5對(duì)SO2的耐受能力最強(qiáng)。通過對(duì)這3種酵母釀造的果酒以及釀酒用橙汁的香氣分析，發(fā)現(xiàn)橙汁原有的香氣物質(zhì)在釀酒過程中有很大變化，對(duì)果酒的香氣組分影響有限，而發(fā)酵釀造賦予了果酒特有的香氣組分。陳釀使酒體的香氣飽滿，期間香氣成分增加了很多，3種酵母釀造的果酒的香氣成分共變化了45種。3種酵母菌釀得的柑橘果酒中香氣組分的主體成分接近，都有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、α-松油醇等13種物質(zhì)，但是各酵母菌種所釀果酒存在特有的香氣成分，庚酸乙酯、萜品油烯等13種物質(zhì)只在L3釀得的柑橘果酒中存在，月桂醇、2-苯乙基酯等8種物質(zhì)只在L5中存在，正辛醇、5-甲基呋喃醛等4種物質(zhì)只存在于L9中?？傊?，3種酵母釀造的果酒有共同的果酒特征香氣物質(zhì)，香氣組分又有特異性差異，基于對(duì)各香氣成分的閾值不同，各成分對(duì)主體香氣的貢獻(xiàn)率也不一樣，不同酵母對(duì)釀造香氣主體的影響，有待于進(jìn)一步深入研究，通過GC-MS結(jié)合GCO進(jìn)行嗅辨分析評(píng)價(jià)各香氣組分的差異對(duì)主體香氣的影響，將有助于對(duì)該問題的深入探討。此外，本實(shí)驗(yàn)中為嚴(yán)格控制單菌種發(fā)酵，對(duì)釀酒用橙汁采用了高溫高壓蒸汽滅菌，可能對(duì)橙汁以及果酒中的香氣組分有較大影響，工藝有待優(yōu)化。

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Effects ofSaccharomyces cerevisiaeStrains from Different Sources on the Aromatic Composition of Orange Wine

LI Rui，F(xiàn)ENG Kui，WU Jing，F(xiàn)AN Gang，PAN Si-yi，XU Xiao-yun*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

TQ920.1

A

1002-6630(2010)17-0206-08

2010-01-05

農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整重大技術(shù)研究專項(xiàng)(04-09-03B)；湖北省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2005AA201C68)

李銳(1987—)，男，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：llirui061202027@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：徐曉云(1970—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：xuxiaoyun@mail.hzau.edu.cn