血管性血友病因子裂解蛋白酶的穩(wěn)定表達(dá)及其活性檢測(cè)

馬珍妮，董寧征，張敬宇，蘇健，汪安友，阮長(zhǎng)耿

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 江蘇省血液研究所 衛(wèi)生部血栓與止血重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215006

血管性血友病因子裂解蛋白酶的穩(wěn)定表達(dá)及其活性檢測(cè)

馬珍妮，董寧征，張敬宇，蘇健，汪安友，阮長(zhǎng)耿

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 江蘇省血液研究所 衛(wèi)生部血栓與止血重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215006

本研究旨在得到重組的血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)，進(jìn)一步研究其在血栓止血中的作用。利用脂質(zhì)體將編碼ADAMTS13全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒pSecTag-ADAMTS13轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用潮霉素(Hygromycin-B)篩選得到陽(yáng)性克隆細(xì)胞株，并擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清。利用 Ni-NTA瓊脂糖柱、梯度咪唑淋洗法純化蛋白，SDS-PAGE和Western blotting鑒定純化產(chǎn)品純度和免疫學(xué)活性，采用GST-His雙抗夾心法測(cè)定蛋白剪切活性。結(jié)果顯示，成功獲得一株能恒定分泌重組ADAMTS13蛋白的細(xì)胞株ADAMTS2-4，每1 L培養(yǎng)上清可純化得到5.8 mg重組蛋白。Western blotting結(jié)果顯示，ADAMTS13多抗能與重組蛋白在190 kDa處顯單一條帶，并且蛋白具有6.4 U/mL的剪切活性(每毫升正常人混合血漿中ADAMTS13活性為1 U)。重組蛋白具有較好的免疫原活性和酶活性，為進(jìn)一步研究ADAMTS13作用機(jī)理和運(yùn)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

血管性血友病因子裂解蛋白酶，真核表達(dá)，重組蛋白

Abstract:This study was to acquire recombinant protein of von Willebrand factor cleaving protease(ADAMTS13, a disintegrin and metalloprotease with a thromboSpondin type 1 motifs 13), for further studies on its biological function in thrombosis and hemostasis.We transfected the Hela cells with the plasmid pSecTag-ADAMTS13 by lipofectamine.A positive cell cloning was selected by hygromycin-B.The recombinant protein was purified with Ni-NTA agarose column by gradient imidazole.The purity and immune activity of purified products were identified with SDS-PAGE and Western blotting respectively.We also measured the enzymatic activity of recombinant protein(rADAMTS13)by GST-His two-site ELISA assay.The results showed that we successfully constructed Hela cells ADAMTS2-4 which expressed high level of rADAMTS13.We received about 5.8 mg recombinant protein in culture supernantants per liter purified with Ni-NTA column.The protein formed a main lane at the position of 190 kDa with SDS-PAGE and reacted with polyclonal antibody against ADAMTS13 by Western blotting.The amount of rADAMTS13 activity was 6.4 U/mL, according to the normal plasma defined as 1 U/mL.In conclusion, rADAMTS13 protein had high purity, immune activity and good enzymatic activity, which could establish the experimental foundation for further research on biological function and mechanism of this unique metalloprotease.

Keywords:von Willebrand factor cleaving protease, eukaryotic expression, recombinant protein

血管性血友病因子裂解蛋白酶(a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif，ADAMTS13，也稱VWF-CP)是1996年發(fā)現(xiàn)的一種血漿金屬蛋白酶，它主要將血漿中大分子量的血管性血友病因子(von Willebrand factor，VWF)多聚體降解成為黏附活性低的小分子片段[1]。VWF是血漿中以多聚體形式存在的糖蛋白，在血管壁發(fā)生損傷時(shí)，對(duì)血小板的黏附與聚集起到至關(guān)重要的作用[2]。內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞內(nèi)主要合成的是大分子量的VWF多聚體(分子量超過(guò)20 000 kDa)，分泌進(jìn)入血液循環(huán)。VWF多聚體的黏附活性取決于分子大小，尤其是超大分子 VWF(UL-VWF)在高剪切力的條件下誘發(fā)血小板過(guò)度聚集。UL-VWF通常能被ADAMTS13切割成更小的片段，以抑制血小板性血栓形成。當(dāng)ADAMTS13活性缺失或存在抗體時(shí)，UL-VWF得以繼續(xù)殘留在血液循環(huán)中，從而引發(fā)血栓性血小板減少性紫癜(TTP)[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS13的基因位于人9號(hào)染色體長(zhǎng)臂(9q34)，由29個(gè)外顯子組成[6]。cDNA含4597 bp以及一個(gè)多聚腺苷酸尾(PolyA tail)，開(kāi)放閱讀框?yàn)?284 bp(109～4392 nt)，編碼1427個(gè)氨基酸。人ADAMTS13具有 9個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，依次為信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、金屬蛋白酶域、去整合素域、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)域、富半胱氨酸域、間隔區(qū)、7個(gè)TSP1重復(fù)基序和2個(gè)CUB域[7]。

本研究擬在人宮頸癌(Hela)細(xì)胞株內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)高水平的具有較高活性的 rADAMTS13蛋白，并且目的蛋白可以分泌到上清中，在Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)能大規(guī)模培養(yǎng)、生產(chǎn)和純化，這為進(jìn)一步研究 ADAMTS13的生物學(xué)功能以及藥物的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

人宮頸癌細(xì)胞株 Hela為本室保存。質(zhì)粒pSecTag-ADAMTS13由美國(guó) Baylor醫(yī)學(xué)院 Dong Jingfei教授惠贈(zèng)[8]，該質(zhì)粒是由ADAMTS13全長(zhǎng)基因(GenBank Accession No.NM_139025.3)引入Hind III 和Xho I兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，重組構(gòu)建入真核表達(dá)載體pSecTag2 A(Invitrogen公司)，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列完全相同。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒中抽試劑盒和Ni-NTA瓊脂糖購(gòu)自Qiagen公司。Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。潮霉素(Hygromycine B)購(gòu)自 Calbiochem 公司。ADAMTS13兔抗人多抗購(gòu)自Abcam公司。GST鼠抗人單抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 6×His-Tag單抗(HRP-Anti-His)、羊抗鼠 IgG(HRP-GAM-IgG)、羊抗兔 IgG(HRP-GAR-IgG)購(gòu)自 Beckman-Coulter公司。硝酸纖維素膜為PALL公司產(chǎn)品。ECL購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司。其他各種試劑和材料均為可獲得的最高標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體pSecTag-ADAMTS13的抽提、鑒定和純化

將 pSecTag-ADMATS13轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Escherchia coli TG1中，涂板，挑取克隆，37℃擴(kuò)增培養(yǎng)，用質(zhì)粒中抽試劑盒抽提質(zhì)粒(按試劑盒說(shuō)明操作)。質(zhì)粒經(jīng)Hind III和Xho I雙酶切鑒定。

1.2.2 陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

Hela細(xì)胞培養(yǎng)：在六孔板中接種 Hela細(xì)胞(2×105/mL)至 40%～60%匯合。轉(zhuǎn)染制備：A液：用無(wú)血清1640培養(yǎng)基稀釋10 μg 質(zhì)粒至250 μL；B液：用無(wú)血清1640培養(yǎng)基稀釋10 μL Lipofectamine 2000至 250 μL；輕輕混合 A、B 液，室溫放置 15 min。轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用無(wú)血清1640培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞1次，再加入1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染：將待轉(zhuǎn)染混合物緩緩加入帶轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，搖勻，37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)6 h，吸除上清，換入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h。陽(yáng)性克隆的篩選：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化后，接種至35 mm的培養(yǎng)皿中(2×103/mL)，換入篩選液(含 400 μg/mL Hygromycine B的10%小牛血清的1640培養(yǎng)基)，至細(xì)胞大部分死亡后換入篩選維持液(含 200 μg/mL Hygromycine B的完全培養(yǎng)基)維持篩選。待陽(yáng)性克隆長(zhǎng)出，再擴(kuò)大培養(yǎng)，即得到穩(wěn)定表達(dá)rADAMTS13蛋白的細(xì)胞株。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞上清的獲得和濃縮

用無(wú)血清 1640培養(yǎng)基馴化穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白的Hela細(xì)胞，大量培養(yǎng)，收集上清。將收集的上清經(jīng)Amicon Ultra-15離心超濾管離心濃縮，以備純化。

1.2.4 重組蛋白純化、透析及其鑒定

上清經(jīng) Ni-NTA瓊脂糖柱，用含不同濃度的咪唑緩沖液(pH 8.0)從低到高梯度淋洗，收集蛋白所在緩沖液，吸入透析袋，用5 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl(pH 8.0)緩沖液透析過(guò)夜。

將純化的蛋白進(jìn)行 10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，ADAMTS13多抗作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，ECL放射顯影，用Western blotting印跡鑒定表達(dá)的蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.5 rADAMTS13酶活性檢測(cè)

ADAMTS13能夠特異地切割VWF A2結(jié)構(gòu)域中的Tyr1605-Met1606肽鍵，調(diào)節(jié)VWF在血漿中分子的大小。將VWF73(Asp1596-Arg1668)的編碼序列插入表達(dá)載體pGEX-6P-1(GE Healthcare公司)，該載體帶有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)標(biāo)簽，同時(shí)設(shè)計(jì)引物在目的片段后加6個(gè)組氨酸(6×His)的DNA序列，通過(guò)大腸桿菌BL21表達(dá)體系，表達(dá)重組蛋白，通過(guò) Ni-NTA柱得到純品，濃度為0.56 mg/mL。得到的 GST-VWF73-His蛋白的N端連有GST標(biāo)簽，C端連有6×His標(biāo)簽。

將 50 μL GST 單抗(10 μg/mL)加入 ELISA板，4℃過(guò)夜，5% BSA在 37℃下封閉2 h。再將濃度為2 μg/mL 的 GST-VWF73-His重組蛋白(25 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.4)在包好的板上每孔加50 μL，室溫反應(yīng)1 h。洗板3次后，將純化后的重組蛋白rADAMTS13以1∶50稀釋后，加入反應(yīng)孔，37℃孵育3 h。將正常人混合血漿倍比稀釋加入反應(yīng)孔，同時(shí)孵育，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線孔。洗板后，加入HRP標(biāo)記的His單抗(1∶1000稀釋)反應(yīng)1 h，TMB顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)[9]。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)載體pSecTag-ADAMTS13的鑒定

將經(jīng)Hind III和Xho I雙酶切后的質(zhì)粒pSecTag-ADAMTS13進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)約4280 bp的目的基因條帶。表明ADAMTS13基因重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。

2.2 陽(yáng)性克隆細(xì)胞上清經(jīng)Western blotting鑒定

經(jīng) Hygromycine B篩選，獲得一株高表達(dá)ADAMTS13蛋白的基因工程細(xì)胞株 ADAMTS2-4。陽(yáng)性克隆細(xì)胞上清經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，Western blotting結(jié)果顯示，抗ADAMTS13的多抗能在190 kDa左右處顯單一蛋白區(qū)帶(圖2)，說(shuō)明上清中分泌的重組蛋白具有較高的免疫學(xué)活性。

2.3 Ni-NTA柱純化后的蛋白鑒定

基因工程細(xì)胞株 ADAMTS2-4經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集無(wú)血清上清經(jīng)超濾濃縮后，上Ni-NTA柱，每1 L培養(yǎng)上清液中可純化得到5.8 mg rADAMTS13純品。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳鑒定，純化產(chǎn)物主要在190 kDa處顯一蛋白條帶(圖3)。

圖1 重組質(zhì)粒pSecTag-ADAMTS13的酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pSecTag-ADAMTS13 by restriction enzyme digestion.1: pSecTag-ADAMTS13 digested with Hind III and Xho I; 2: DL15 000 DNA marker.

圖2 Western blotting鑒定重組蛋白Fig.2 Western blotting analysis of the recombinant protein.1:prestained protein marker; 2: supernatant from untransfected Hela cells; 3: supernatant from transfected Hela cells ADAMTS2-4.

圖3 SDS-PAGE電泳檢測(cè)Ni-NTA柱純化后的上清蛋白Fig.3 Reducing SDS-PAGE analysis of cell supernatant after flowing through Ni-NTA agarose column.1: low weight protein marker; 2: supernatant flowing through the Ni-NTA agarose column without binding on it; 3–5: wash by wash buffer with iminazole(20 mmol/L); 6: eluate by eluate buffer with iminazole(50 mmol/L); 7,8: eluate by eluate buffer with iminazloe(250 mmol/L).

2.4 rADAMTS13蛋白酶的活性檢測(cè)

正常人混合血漿經(jīng)倍比稀釋，檢測(cè)值作標(biāo)準(zhǔn)曲線為 lgy=0.18?0.67lgx(R2=0.9465，x=ADAMTS13活性百分?jǐn)?shù)，y=OD450值)，設(shè)定正常人混合血漿中ADAMTS13的活性為1 U/mL，代測(cè)的rADAMTS13的活性為6.4 U/mL。

3 討論

血漿中的 ADAMTS13主要來(lái)源于肝臟的星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSC)，同時(shí)在全身多個(gè)組織和臟器中均有微量的表達(dá)。ADAMTS13基因廣泛存在于哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)中，其中小鼠的ADAMTS13基因與人的具有很高的同源性。直到1996年，Tsai和 Fulan才在血漿中純化出ADAMTS13蛋白[10]。直接從血漿中分離天然的ADAMTS13蛋白雖然活性好，難以大量制備，而利用體外基因重組技術(shù)可以解決這一問(wèn)題。

ADAMTS13全長(zhǎng)序列編碼 1427個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為154 kDa左右，但由于糖基化和豐富的半胱氨酸，SDS-PAGE電泳顯示有190 kDa。在真核細(xì)胞中表達(dá)，更有利于獲得活性較高并更接近與自然合成的ADAMTS13蛋白。利用脂質(zhì)體，將表達(dá)載體 pSecTag-ADAMTS13導(dǎo)入 Hela細(xì)胞株，該細(xì)胞株自身有內(nèi)源性的Furin蛋白，能夠切割前導(dǎo)肽并釋放成熟的蛋白到培養(yǎng)的上清中，成為可溶性蛋白，大量培養(yǎng)后，收集其上清液可進(jìn)行分離純化。

本研究結(jié)果表明，重組質(zhì)粒經(jīng) lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，經(jīng)Hygromycine B篩選，獲得一株高表達(dá) rADAMTS13蛋白的基因工程細(xì)胞株ADAMTS2-4。將細(xì)胞株ADAMTS2-4培養(yǎng)無(wú)血清上清經(jīng)超濾濃縮后，利用載體上帶的 6×His標(biāo)簽，經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖柱不同濃度咪唑梯度淋洗純化蛋白，使蛋白處于自然狀態(tài)，保證了酶的活性。經(jīng)SDS-PAGE電泳和 Western blotting顯示，純化的rADAMTS13大小約為 190 kDa，與預(yù)期的大小相符，并且商品化的抗ADAMTS13多抗能與其特異性結(jié)合。

有研究表明，VWF73(Asp1596-Arg1668)包含有ADAMTS13切割VWF的酶切位點(diǎn)Tyr1605-Met1606，是 ADAMTS13作用的最小底物[11]。利用基因重組的方法，得到了較純的N端連有GST標(biāo)簽，C端連有6×His的重組蛋白GST-VWF73-His。利用GST單抗包板，將 GST-VWF73-His蛋白與之結(jié)合，再將rADAMTS13與之反應(yīng)，若酶將VWF73的C末端切掉后，再用 His單抗檢測(cè)，讀數(shù)會(huì)降低，可以反應(yīng)出ADAMTS13切割VWF的活性大小。本實(shí)驗(yàn)利用以上方法，以正常人混合血漿倍比稀釋，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到純品活性為6.4 U/mL，可見(jiàn)得到的重組蛋白保持了較好的剪切活性。

總之，基因工程細(xì)胞株ADAMTS2-4能穩(wěn)定高表達(dá)重組蛋白 rADAMTS13，純化的產(chǎn)品具有較高的免疫學(xué)活性和生物學(xué)酶活性，并且可長(zhǎng)期大量獲得，為下一階段研究ADAMTS13生物學(xué)功能和作用機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Stable expression and characterization of the von Willebrand factor cleaving protease

Zhenni Ma, Ningzheng Dong, Jingyu Zhang, Jian Su, Anyou Wang, and Changgeng Ruan
Key Laboratory of Thrombosis and Hemostasis, Ministry of Health, Jiangsu Institute of Hematology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, China

Received:August 27, 2009;Accepted:December 24, 2009

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30670904).

Corresponding author:Changgeng Ruan.Tel: +86-512-67780418; Fax: +86-512-65113556; E-mail: changgengruan@hotmail.com國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30670904)資助。