肽鏈釋放因子和核糖體蛋白L11在八肋游仆蟲細胞中的定位

柴寶峰，李娜，王景濤，申泉，張志云，梁愛華

山西大學生物技術(shù)研究所 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006

肽鏈釋放因子和核糖體蛋白L11在八肋游仆蟲細胞中的定位

柴寶峰，李娜，王景濤，申泉，張志云，梁愛華

山西大學生物技術(shù)研究所 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006

原生動物纖毛蟲是一類單細胞真核生物，其蛋白質(zhì)合成終止過程中密碼子使用的特殊性使其成為研究蛋白質(zhì)合成終止機制的一個經(jīng)典模型。為了能夠有效地分析生物大分子在該細胞中的功能作用位點，本研究根據(jù)該生物染色體結(jié)構(gòu)的特征，構(gòu)建了含有紅色熒光蛋白基因的大核人工染色體EoMAC_R，并與之前構(gòu)建的含綠色熒光蛋白基因的大核染色體EoMAC_G一起，對蛋白質(zhì)合成終止有關(guān)的3個重要因子核糖體大亞基蛋白L11、多肽鏈釋放因子eRF1和eRF3在八肋游仆蟲細胞中進行了熒光共定位分析。結(jié)果顯示，在八肋游仆蟲細胞中，蛋白質(zhì)翻譯過程主要位于“C”形大核內(nèi)側(cè)區(qū)域。構(gòu)建的人工染色體能夠作為一種有效的工具，對目的蛋白質(zhì)在八肋游仆蟲細胞中進行定位分析。

人工染色體，纖毛蟲，細胞定位，肽鏈釋放因子

Abstract:Protozoan ciliates are a group of unicellular eukaryotes.The special characteristics of stop codons usage in termination of protein biosynthesis in ciliates cells makes them an ideal model to study the mechanism of stop codon recognition of polypeptides release factors.To localize the functional positions of biomolecules in ciliates cell, we constructed a macronuclear artificial chromosome containing a gene encoding red fluorescence protein(EoMAC_R)based on the structural characteristics of ciliates chromosome.Three factors, L11, eRF1a, and eRF3 that are involved in termination process of protein synthesis were colocalized in Euplotes octocarinatus cells by using novel EoMAC_R and the previously constructed EoMAC_G.The results indicated that protein synthesis mainly occurred inside the “C” shape macronucleus, suggesting that EoMAC could be a useful tool for localizing biomolecules in ciliates cell.

Keywords:macronuclear artificial chromosome, ciliates, cellular localization, polypeptides release factors

原生動物纖毛蟲是一類單細胞真核生物，其蛋白質(zhì)合成終止過程中密碼子使用的特殊性[1-2]使其成為研究蛋白質(zhì)合成終止機制的一個經(jīng)典模型。四膜蟲Tetrahymena和草履蟲Paramecium細胞中UAA和UAG編碼谷氨酰胺，僅UGA作為終止密碼子；在八肋游仆蟲Euplotes octocarinatus細胞中UAA或UAG作為終止密碼子，而 UGA編碼半胱氨酸[3]。說明纖毛蟲第一類肽鏈釋放因子在識別終止密碼子的機制上與高等真核生物具有一定的差異，這為研究真核生物蛋白質(zhì)合成終止機制提供了參照工具，并成為分子細胞生物學研究的熱點之一[4-9]。

纖毛蟲有兩種細胞核，小核負責遺傳物質(zhì)的傳遞，大核是營養(yǎng)核，具有轉(zhuǎn)錄活性。在大核中的染色體結(jié)構(gòu)具有一定的特殊性，即一個染色體中只有一個基因[10]。每條染色體均以不同的高拷貝數(shù)決定其在細胞中的表達水平[11]。在纖毛蟲細胞中有大量“C4A4C4A4C4A4C4”結(jié)構(gòu)的端粒，維持了細胞分裂過程中大核染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[10]?；诖?，本研究構(gòu)建了八肋游仆蟲含熒光蛋白的大核人工染色體，對蛋白質(zhì)合成終止有關(guān)的一些因子，諸如核糖體大亞基蛋白L11[12]、肽鏈釋放因子eRF1和eRF3[13]在細胞中進行了定位分析。

1 材料與方法

1.1 材料

八肋游仆蟲E.octocarinatus由德國明斯特大學K.Heckmann教授惠贈，用綠梭藻蟲 Chlorogoium elongatum喂食培養(yǎng)[14]。如無特殊說明，本研究所用的酶和試劑均購自TaKaRa公司(大連)。pEGFP-N1綠色熒光和 pDsRed1-N1紅色熒光蛋白表達質(zhì)粒購自Clontech公司。含綠色熒光蛋白基因的八肋游仆蟲大核人工染色體(EoMAC_G)載體系本實驗室構(gòu)建[15]，用于八肋游仆蟲細胞定位分析。

1.2 引物

本研究中基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建過程中所用引物見表1，這些引物均由TaKaRa(大連)公司合成。

1.3 方法

1.3.1 八肋游仆蟲含紅色熒光蛋白基因人工大核染色體的構(gòu)建

pDsRed1-N1是能夠在哺乳動物細胞中高效表達紅色熒光蛋白的表達載體，大小為 4.7 kb，以該質(zhì)粒為原始載體，在其紅色熒光蛋白基因的上下游分別插入八肋游仆蟲 β2-tubulin基因端粒及 5′-和3′-UTR序列，使表達載體 pDsRed1-N1中 DsRed基因的兩側(cè)帶有八肋游仆蟲 β2-tubulin微管蛋白基因的上下游調(diào)控序列，確保其在八肋游仆蟲細胞中穩(wěn)定遺傳和高效表達。從本實驗室之前構(gòu)建的含綠色熒光基因的八肋游仆蟲大核人工染色體 EoMAC_G的 pBTub-Tel載體[15]中用 SnaBⅠ和 BamH Ⅰ雙酶切，得到 β2-tubulin基因的表達調(diào)控序列和端粒序列，然后克隆到pDsRed1-N1質(zhì)粒相應的酶切位點，即在紅色熒光蛋白基因的上游加上了 β2-tubulin基因的表達調(diào)控序列和端粒結(jié)構(gòu)；設計引物(表 1中PBeta2F 和PBeta2R)，從 EoMAC_G的 pBTub-Tel載體上擴增 β2-tubulin基因的下游表達調(diào)控序列和端粒序列，用Not I 單酶切后連接到紅色熒光蛋白基因的下游。最終得到含有β2-tubulin基因上下游基因表達調(diào)控序列和端粒結(jié)構(gòu)的紅色熒光蛋白基因的大核人工染色體(EoMAC_R)的重組質(zhì)粒(pDsRed1-N1-Tel)，多克隆位點位于紅色熒光蛋白基因和5′-UTR之間。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.2 含L11、eRF1a和eRF3基因的熒光表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建

設計引物(表1中 PL11F和PL11R)，以本實驗室之前構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pGEX-6p1-L11為模板[12]，擴增L11基因。用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切連接到pDsRed1-N1-Tel載體中，構(gòu)建成L11與紅色熒光蛋白融合表達的重組載體 pDsRed1-N1-Tel-L11。設計引物(表 1，PeRF3F/PeRF3R；PeRF1aF/PeRF1aR)，分別從 pGADT7-eRF3和 pGBKT7-eRF1a[6]中克隆eRF1a基因和eRF3基因，產(chǎn)物經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，分別克隆至載體 pBTub-Tel和 pDsRed1-N1-Tel相應酶切位點，構(gòu)建成綠色熒光和紅色熒光蛋白基因分別與兩類肽鏈釋放因子基因融合表達的重組載體pBTub-Tel-eRF1a、pDsRed1-N1-Tel-eRF1a和pBTub-Tel-eRF3，用于轉(zhuǎn)化八肋游仆蟲細胞。

1.3.3 八肋游仆蟲細胞的處理及目的基因的轉(zhuǎn)染與觀察

八肋游仆蟲細胞的處理、富集及外源DNA轉(zhuǎn)染見文獻[15]。轉(zhuǎn)染后 16～24 h，Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡觀察定位結(jié)果。

1.3.4 融合蛋白基因表達的Western blotting鑒定

綠色熒光和紅色熒光蛋白基因及其與相應的融合蛋白基因 EGFP-eRF1a、EGFP-eRF3在八肋游仆蟲細胞中的表達用Western blotting進行鑒定，GFP作為標簽，其單克隆抗體作為一抗，確認融合蛋白的表達。操作步驟與李娜等所用的方法[15]完全一致。

2 結(jié)果與討論

2.1 八肋游仆蟲含紅色熒光蛋白基因人工大核染色體的構(gòu)建

在構(gòu)建了含綠色熒光蛋白基因的八肋游仆蟲大核人工染色體(EoMAC_G)的基礎上[15]，為了便于在原生動物纖毛蟲細胞中進行蛋白質(zhì)共定位的研究，又構(gòu)建了含紅色熒光蛋白基因的八肋游仆蟲大核人工染色體(EoMAC_R)。該染色體的5′和3′端分別帶有一個八肋游仆蟲 β2-tubulin基因的端粒結(jié)構(gòu)C4A4C4A4C4A4C4；其內(nèi)側(cè)分別為β2-tubulin基因表達的上下游調(diào)控序列(49 bp和121 bp)[16]；中部含一個多克隆位點和一個編碼紅色熒光蛋白的基因。EoMAC_R克隆在pDsRed-N1載體中，形成重組質(zhì)粒 pDsRed1-N1-Tel。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和 PCR鑒定(圖1)，基因片段大小符合預期，最終經(jīng)過測序確認正確。

將帶有人工染色體的質(zhì)粒 pBTub-Tel和pDsRed1-N1-Tel分別轉(zhuǎn)染經(jīng)過饑餓處理的八肋游仆蟲細胞。48 h后觀察熒光的表達水平(圖2)。大核人工染色體所攜帶的綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白基因在八肋游仆蟲細胞中得到高效表達，而且在細胞中呈均勻分布(圖2A、2B)。而沒有轉(zhuǎn)化的細胞中無明顯的熒光信號(圖2C)。

2.2 含L11、eRF1a和eRF3基因的熒光表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用表1中PL11F和PL11R為引物，以pGEX-6p1-L11為模板[12]，擴增編碼八肋游仆蟲核糖體大亞基蛋白 L11的全長基因(531 bp)。用 BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，連接到pDsRed1-N1-Tel載體的多克隆位點中，構(gòu)建成L11與紅色熒光蛋白融合表達的重組載體pDsRed1-N1-Tel-L11。酶切和PCR鑒定正確(圖3A)。用表1中的PeRF3F/PeRF3R和PeRF1aF/PeRF1aR為引物，分別從重組質(zhì)粒 pGADT7-eRF3和pGBKT7-eRF1a[6]中克隆eRF1a(1338 bp)基因和eRF3(2400 bp)基因，產(chǎn)物經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，分別克隆至載體pBTub-Tel和pDsRed1-N1-Tel相應酶切位點，構(gòu)建成含有綠色熒光和紅色熒光蛋白分別與肽鏈釋放因子融合表達的重組質(zhì)粒 pBTub-TeleRF1a、pDsRed1-N1-Tel-eRF1a和 pBTub-Tel-eRF3，3個重組質(zhì)粒分別經(jīng)酶切和PCR鑒定后(圖3B和圖4)，測序確認正確，用于下一步的八肋游仆蟲細胞轉(zhuǎn)化。

圖1 重組載體pDsRed1-N1-Tel的PCR及酶切鑒定Fig.1 Analysis of recombinant vector pDsRed1-N1-Tel by PCR and enzyme digestion.M: DNA ladder; 1: pDsRed1-N1-Tel containing EoMAC_R; 2: PCR product of the 3′ untranslating region and telomere of β2-tubulin from pDsRed1-N1-Tel; 3:pDsRed1-N1-Tel digested with NotⅠ.

圖2 綠色熒光和紅色熒光蛋白基因在八肋游仆蟲細胞中的表達Fig.2 Expression of GFP and RFP gene in E.octocarinatus cells.(A)EGFP gene in EoMAC-G was expressed in Euplotes cell.(B)RFP gene in EoMAC-R was expressed in Euplotes cell.(C)Euplotes cell without transfection.

圖3 重組質(zhì)粒 pDsRed1-N1-Tel-L11(A)和 pBTub-TeleRF1a(B)的鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pDsRed1-N1-Tel-L11(A)and pBTub-Tel-eRF1a(B).M: DNA marker; 1:plasmid pDsRed1-N1-Tel and pBTub-Tel, respectively; 2:recombinant vectors; 3: PCR product of L11 and eRF1a gene from the recombinant vectors; 4: the recombinant vectors digested with Hind Ⅲ and BamH I, respectively.

圖4 重組質(zhì)粒pDsRed1-N1-Tel-eRF1a(A)和pBTub-TeleRF3(B)的鑒定Fig.4 Identification of the recombinant plasmid pBTub-TeleRF1a(A)and pBTub-Tel-eRF3(B).M: DNA marker; 1: the plasmid pDsRed1-N1-Tel and pBTub-Tel; 2: the recombinant plasmid pDsRed1-N1-Tel-eRF1a and pBTub-Tel-eRF3; 3: the recombinant plasmid digested with Hind Ⅲ a nd BamHⅠ; 4:PCR product of eRF1a and eRF3 from the recombinant plasmid,respectively.

2.3 肽鏈釋放因子eRF1a與L11蛋白在八肋游仆蟲中的共定位

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pDsRed1-N1-Tel-L11與pBTub-Tel-eRF1a轉(zhuǎn)化經(jīng)過饑餓處理的八肋游仆蟲細胞，16～24 h后觀察細胞內(nèi)熒光蛋白的表達量和分布。如圖5所示，第一類肽鏈釋放因子和核糖體大亞基L11蛋白主要定位在細胞質(zhì)中的大核附近。尤其 eRF1a的分布(綠色熒光)沿核膜周圍形成一個大核(DAPI染色)的輪廓。在“C”形大核的內(nèi)側(cè)，在一個圓形區(qū)域中，二者的分布比較集中，該區(qū)域是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布比較集中的部位，蛋白質(zhì)翻譯活動比較強烈。另外，在細胞膜(皮層)附近，也有較強的熒光定位信號，這些部位是纖毛蟲細胞線粒體集中的部位[17]，線粒體有獨立的基因組和蛋白質(zhì)翻譯機器，其中有活躍的蛋白質(zhì)翻譯活動。圖中還可以看到，在大核內(nèi)有明顯的綠色熒光分布，說明其中有第一類肽鏈因子的存在。關(guān)于肽鏈釋放因子在細胞核中的功能多有報道，與細胞核內(nèi)微管的組裝有一定的關(guān)系[18]，從而影響細胞的有絲分裂過程。有研究表明，在真核細胞的核中有蛋白質(zhì)翻譯過程的存在[19]，即與原核生物一樣，在細胞核中基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯耦聯(lián)在一起，盡管這一結(jié)論有待進一步的證實，肽鏈釋放因子在核中的定位也給予該結(jié)論一定的支持。

圖5 eRF1a與L11在八肋游仆蟲細胞中的共定位Fig.5 Co-localization of eRF1a and L11 in E.octocarinatus.Observed by using laser scanning confocal microscope, Leica TCS SP5.

由于eRF1a 和eRF3均克隆自八肋游仆蟲細胞，故以 GFP作為標簽，利用 GFP的單克隆抗體(Chemicon，USA)進行Western blotting分析，根據(jù)目的蛋白的預期大小和Western blotting結(jié)果(圖6)，進一步證實了外源目的基因eRF1a和eRF3在八肋游仆蟲細胞中得到了高效表達。

圖6 熒光蛋白及其融合蛋白在細胞中表達的 Western blotting鑒定Fig.6 Western blotting analysis of expression of fluorescence protein and fusion proteins in Euplotes cells.M: wide range protein marker; 1: GFP; 2: fusion protein GFP-eRF1a; 3: fusion protein GFP-eRF3.

圖7 肽鏈釋放因子eRF1a與eRF3在八肋游仆蟲中的共定位Fig.7 Co-localization of polypeptide release factors eRF1a and eRF3 in E.octocarinatus cell.

2.4 肽鏈釋放因子eRF3與eRF1a在八肋游仆蟲細胞中的共定位

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pDsRed1-N1-Tel-eRF1a與pBTub-Tel-eRF3轉(zhuǎn)化經(jīng)過饑餓處理的八肋游仆蟲細胞，16～24 h后觀察細胞內(nèi)熒光蛋白的表達量和分布。如圖7所示，兩類肽鏈釋放因子在細胞中也有共定位，而且集中在“C”形大核的內(nèi)側(cè)。該區(qū)域的DAPI染色較深，說明有核酸物質(zhì)分布，是蛋白質(zhì)翻譯的主要場所。

細胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯過程和場所分布在原核生物和高等真核生物細胞中的研究比較深入，盡管在機制上還有諸多不清楚的地方，但在許多方面取得了一致的意見。粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是核糖體附著的主要場所，其與核膜聯(lián)結(jié)，核孔中運出的mRNA直接參與“核糖體與 mRNA”翻譯起始復合體的形成，減少mRNA運輸過程中的損耗。在原生動物纖毛蟲細胞中，有大核和小核，小核負責遺傳物質(zhì)的傳遞，大核是營養(yǎng)核，具有轉(zhuǎn)錄活性，蛋白質(zhì)翻譯過程主要集中在大核附近。關(guān)于該類生物蛋白質(zhì)翻譯的過程和機制的研究才剛開始，尤其是該類生物細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成新生肽鏈釋放過程中終止密碼子識別的特殊性，使其成為肽鏈釋放因子識別終止密碼子機制研究的一個經(jīng)典模型，蛋白質(zhì)翻譯的終止機制是近年來分子細胞生物學研究的一個熱點課題[4,9,20-22]。本研究構(gòu)建的八肋游仆蟲大核人工染色體為研究原生動物纖毛蟲細胞內(nèi)的大分子的功能作用位點提供了有效的工具。

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Localization of polypeptides release factors and ribosome protein L11 in Euplotes octocarinatus

Baofeng Chai, Na Li, Jingtao Wang, Quan Shen, Zhiyun Zhang, and Aihua Liang
Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

Received:October 9, 2009;Accepted:December 17, 2009

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.30770294, 30940043, 30670282), Natural Science Foundation of Shanxi Province(No.2009011040-1).

Corresponding author:Baofeng Chai.Tel: +86-351-7019083; E-mail: bfchai@sxu.edu.cn國家自然科學基金(Nos.30770294, 30940043, 30670282)，山西省自然科學基金(No.2009011040-1)資助。