布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶在大腸桿菌中的克隆、表達、純化及活性測定

姚瓔，杲光偉，李大偉

上海交通大學藥學院，上海 200240

布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶在大腸桿菌中的克隆、表達、純化及活性測定

姚瓔，杲光偉，李大偉

上海交通大學藥學院，上海 200240

苯丙氨酰-tRNA合成酶是布氏錐蟲蛋白合成過程中的一類重要酶，以其為靶點的抑制劑可能發(fā)展成為新一代的抗錐蟲藥物，但此前并沒有分離錐蟲苯丙氨酸-tRNA合成酶的報道。本研究用大腸桿菌成功克隆表達并純化了布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶并進行了活性測定。首先通過PCR方法從布氏錐蟲細胞基因組中分別擴增出苯丙氨酰-tRNA合成酶的α亞基、β亞基的基因，依次克隆入pCOLADuet共表達載體，然后在大腸桿菌BL21(DE3)RIPL中進行了成功表達，并采用Ni-Bind親和層析對其進行了純化，最后用免疫印跡進行了鑒定。此外還采用放射性同位素方法進行了酶活性測定，這為下一步進行布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶抑制物的設(shè)計和體外篩選奠定了良好的基礎(chǔ)。

布氏錐蟲，苯丙氨酰-tRNA合成酶，原核表達，純化，酶活測定

Abstract:Phenylalanyl-tRNA synthetase is a key enzyme for protein synthesis in Trypanosoma.Its validation as an inhibition target will enable the development of a new generation of anti-Trypanosoma drugs.However, little is known about the isolation of the Trypanosoma Phenylalanyl-tRNA synthetase.Here we report the cloning, expression, purification and activity assay of Phenylalanyl-tRNA synthetase from Trypanosoma brucei in Escherichia coli host.We co-cloned the α-subunit and β-subunit of Phenylalanyl-tRNA synthetase from Trypanosoma brucei genomic DNA into the co-expression vector pCOLADuet.We successfully expressed the Trypanosoma brucei Phenylalanyl-tRNA synthetase in E.coli host, purified the whole enzyme by Ni-Hind affinity column and verified it by Western blotting.In addition, we tested its enzymatic activity by isotope labeling.The whole work laid a solid foundation for in vitro the screening and optimization of Trypanosoma brucei phenylalanyl-tRNA synthetase inhibitors.

Keywords:Trypanosoma brucei, phenylalanyl-tRNA synthetase, prokaryotic expression, purification, enzyme activity assay

布氏錐蟲是一種在撒哈拉以南非洲地區(qū)所特有的寄生蟲，當侵入寄主后會引起非洲錐蟲病或昏睡病，每年都會引起非常嚴重的死亡率和和令人震驚的社會和經(jīng)濟后果[1]。目前市場上存在的治療熱帶寄生蟲的藥物多數(shù)有藥物毒性、抗藥性等導致的療效有限問題；由于這些疾病主要影響世界貧困地區(qū)的貧困人口，長久以來很難成為醫(yī)藥企業(yè)關(guān)注的目標市場。但如今的籌資情況發(fā)生了很大的變化，世界衛(wèi)生組織(WHO)瘧疾新藥研發(fā)(DNDi)等機構(gòu)以及一些慈善機構(gòu)已經(jīng)高度重視熱帶寄生蟲病，并且加大了在這方面的支持[2-3]。

近年來，生物化學的大力發(fā)展，以及錐蟲基因組序列的陸續(xù)破解，為尋找新的藥物作用靶點提供了很好的基礎(chǔ)。氨酰 tRNA合成酶(AaRS)作為蛋白質(zhì)生物合成過程中的一類關(guān)鍵酶，成為了抗錐蟲藥物的重要靶點[4]。然而在抗錐蟲藥物方面，以AaRS為靶點的藥物還鮮有報道，目前國內(nèi)外尚未看到任何有關(guān)以布氏錐蟲苯丙氨酰 tRNA合成酶(PheRS)為靶標的篩選方法的建立。

苯丙氨酰 tRNA 合成酶(PheRS)是 AaRS家族中最為復雜的酶之一，由(αβ)2四聚體構(gòu)成[5]。由于其結(jié)構(gòu)的復雜性使得長期以來活性 PheRS的制備成為研究熱點。本研究首次將布氏錐蟲PheRS基因在大腸桿菌BL21(DE3)RIPL中進行了成功克隆表達，并用Ni-Bind親和層析對蛋白進行了純化，用免疫印跡進行了驗證，還進行了酶活性測定的研究，這為進一步以其為靶點進行酶抑制劑設(shè)計和體外篩選獲得抗非洲錐蟲病新藥前體奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 實驗材料

質(zhì)粒和菌種：表達載體 pCOLADuet購自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3)RIPL由本實驗室保存。

酶與主要試劑、儀器：限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶均購自Fermentas公司；IPTG購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒均購自北京索萊寶生物技術(shù)公司；Ni-Bind純化系統(tǒng)購自Novagen 公司；[14C]亮氨酸購自Perkin-Eilmer，啤酒酵母tRNA購自Roche，其余試劑均為國產(chǎn)分析純；閃爍計數(shù)儀購自BechmanLS6500。

2 實驗方法

2.1 9種不同物種的PheRS氨基酸序列比對

從NCBI的GenBank 數(shù)據(jù)庫中調(diào)取布氏錐蟲和其他物種的PheRS氨基酸序列，用Clustal W軟件來分析同源序列比對。

2.2 PheRS α亞基、β亞基基因的獲得和重組質(zhì)粒pCOLADuet-PheRSαβ的構(gòu)建

根據(jù)已知的PheRS的α亞基、β亞基基因序列設(shè)計引物。α亞基的引物 F為 5'-GAGCGAATTCT ATGAGTACCATGGAG-3'，引物R為 5'-CGAAGCTT AAAACGCATTAGCTTTG-3'(下劃線分別表示EcoR I和 Hind III酶切位點)。β亞基的引物 F為5'-ATCAGATCTATGCCAACCCTCGC-3'，引物R為5'-ATACTCGAGTCACTGGGCAAACTG -3'(下劃線分別表示Bgl II和Xho I酶切位點)。采用上述引物以布氏錐蟲的基因組為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物用DNA純化試劑盒回收，以EcoR I-Hind III酶切α亞基基因片段，克隆入同樣經(jīng)EcoR I-Hind III酶切消化的pCOLADuet載體，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，分離獲得重組質(zhì)粒pCOLADuet- PheRSα，經(jīng)酶切鑒定和測序正確后，用于 β亞基的克隆。以Bgl II-Xho I酶切β亞基基因片段，克隆入同樣經(jīng)Bgl II-Xho I酶切消化的pCOLADuet-PheRSα載體，經(jīng)酶切及測序鑒定后構(gòu)建正確的共表達載體pCOLADuet-PheRSαβ用于蛋白表達。

2.3 重組菌的誘導表達優(yōu)化

重組共表達質(zhì)粒 pCOLADuet-PheRSαβ轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)RIPL中，在含卡那青霉素(30 μg/mL)的LB培養(yǎng)液中37℃中過夜培養(yǎng)。次日以1:1000(V/V)的比例接種于新鮮培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至A550為0.6～0.8時，設(shè)定IPTG誘導濃度0.01、0.025、0.05、1、1.25 mmol/L，采用 37℃誘導 4 h及25℃過夜誘導兩種方式來誘導重組菌的表達，以確定最佳蛋白誘導條件。

2.4 重組蛋白的表達和純化

4℃離心，收集菌體，超聲破碎，離心后收集上清液。上清液根據(jù)Novagen的His-Bind purification kit的操作手冊進行親和色譜純化，依次在添加柱材料的交換柱中加入3倍柱床體積的去離子水，5倍柱床體積的交換緩沖液(50 mmol/L硫酸鎳)進行鎳離子的交換，6倍柱床體積的結(jié)合緩沖液(0.5 mol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)，上清液過柱，10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液，6倍柱床體積的洗滌緩沖液(0.5 mol/L NaCl，60 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)，6倍柱床體積洗脫緩沖液(1 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)，分管收集洗脫液。SDS-PAGE分析洗脫結(jié)果后，收集合并含酶部分，經(jīng)透析液(1×PBS，甘油 50%(V/V)，β-巰基乙醇 5 mmol/L，pH 6.8)過夜透析后，?20℃保存洗脫的蛋白用 8%的SDS-PAGE電泳進行純化效果的鑒定。

2.5 免疫印跡鑒定

誘導前的菌液、IPTG誘導后的菌液、純化的蛋白樣品進行SDS-PAGE后，4℃、300 mA、2 h電轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜上。將膜置于雜交袋中，封閉液室溫封閉1 h。棄溶液后，再加入用封閉液1:5000稀釋的特異性抗His標簽的單抗，4℃過夜。以TBS-T洗膜3次后，加入HRP-山羊抗小鼠IgG抗體，用封閉液1:40 000稀釋，室溫孵育1 h。TBS-T洗膜3次后，將膜用 ECL-Plus處理后，于暗室曝光到 X-膠片上，顯影3 min，定影3 min。

2.6 PheRS的酶活性分析

采用放射性同位素法，以酶催化生成[14C]-Phe-tRNA復合物的量來測定酶活力。在酶反應(yīng)緩沖體系：50 mmol/L(pH 7.8)HEPES-KOH，5 mmol/L MgCl2，45 mmol/L KCl， 9 μmol/L [14C]-Phe(0.1 μCi/μL)，0.4 mg/mL啤酒酵母 tRNA，0.02%(W/V)BSA，1 mmol/L DTT，10%(V/V)DMSO，苯丙氨酰tRNA合成酶21 μL(純化后酶稀釋1000倍)。上述物質(zhì)混勻后，加入終濃度為2 mmol/L ATP時反應(yīng)起始，混合物終體積為70 μL。37℃恒溫反應(yīng)，在20 min內(nèi)每間隔5 min各取3等份20 μL反應(yīng)液分別滴加到定性濾紙上，并立即投入到5% TCA溶液100 mL中浸泡洗滌，重復3次；將取出的濾紙再投入到95%酒精中浸泡洗滌，重復 3次。濾紙置于紅外燈下烘干，閃爍計數(shù)儀測定[6]。1 U酶定義在上述最適反應(yīng)條件下每分鐘生成1 nmol產(chǎn)物[14C]-Phe -tRNA時的酶量。根據(jù)李振權(quán)等[7]介紹的以下公式計算每毫升酶單位(U/mL)：

U/mL= K×(CPM2?CPM3)×稀釋倍數(shù)

公式中：CPM1為[14C]-Phe總放射量；CPM2為加入酶反應(yīng)后的CPM值；CPM3為背景放射，只加[14C]-Phe不加酶的CPM值。

3 結(jié) 果

3.1 不同物種的PheRS氨基酸序列比對

將布氏錐蟲和目前已成功表達的幾種物種的PheRS，主要是細胞質(zhì)的PheRS進行了同源性分析，圖1是經(jīng)Clustal W分析后的進化樹結(jié)果。比較幾種物種的α亞基和β亞基同源性，發(fā)現(xiàn)PheRS明顯分為真核生物類、原核生物類和古細菌類3種。無論從α亞基還是β亞基比較，布氏錐蟲的PheRS都與人源性及酵母類的PheRS同源性最高。由于人源性細胞質(zhì)PheRS已成功表達，這為同源性較高的布氏錐蟲的PheRS克隆表達提供了很好的基礎(chǔ)。

3.2 苯丙氨酰tRNA合成酶表達載體的構(gòu)建

從 GenBank中分別查出布氏錐蟲 PheRSα和PheRSβ的基因分別為1491 bp和1875 bp。以布氏錐蟲的全基因組為模板，采取了 PCR擴增的方式獲得PheRS的α亞基和β亞基的基因片段，從圖2可以看出擴增得到的目的基因片段大小與預期結(jié)果一致。

圖3中是構(gòu)建共表達質(zhì)粒pCOLADuet-PheRSαβ的圖譜，其中α亞基N-端融合有His標簽，而β亞基N-和C-端均沒有標簽蛋白。圖4是重組后的表達質(zhì)粒的酶切圖譜，從 A 圖中可以看出pCOLADuet-PheRSα用EcoR I和Hind III雙酶切，獲得載體片段(3.7 kb)與目的基因片段(1.5 kb)。B圖中共表達質(zhì)粒pCOLADuet-PheRSαβ用BamH I酶切，獲得片段2.6 kb和4.4 kb，酶切片段的大小與預期相符。

3.3 PheRS蛋白的表達及純化

圖1 已成功表達的PheRSα和PheRSβ的進化樹圖譜Fig.1 Phylogenetic tree of PheRSα and PheRSβ that has been expressed successfully.The phylogenetic tree was constructed by the Neighbor-Joining method.Phenylalanyl-tRNA synthetase subunit alpha: Homo sapiens(NP_004452), Saccharomyces cerevisiae(NP_116631), Trypanosoma brucei(XP_829468),Thermococcus kodakarensis (YP_183334), Pyrococcus horikoshii(NP_142612), Methanocal-dococcus jannaschii(NP_247463), Escherichia coli(YP_001458493), Bacillus subtilissubsp (NP_390742), Thermus thermophilus(YP_145224), Phenylalanyl-tRNA synthetase beta chain, Homo sapiens(NP_005678), Saccharomyces cerevisiae(NP_013161),Trypanosoma brucei(XP_828320), Thermococcus kodakarensis(YP_183338), Pyrococcus horikoshii (NP_142611),Methanocal-dococcus jannaschii(NP_248101), Escherichia coli(YP_001458492), Bacillus subtilissubsp(NP_390741),Thermus thermophilus(YP_145225).

圖2 錐蟲PheRS基因的克隆Fig.2 Amplification of PheRS gene from T.brucei genomic DNA by PCR.M: DNA marker; 1: PheRSα gene fragment; 2:PheRSβ gene fragment.

圖3 重組質(zhì)粒pCOLADuet-PheRSαβ的示意圖Fig.3 Schematic map of the recombinant plasmid pCOLADuet-PheRSαβ.

圖4 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant expression plasmid by enzyme digestion.(A)Recombinant plasmid pCOLADuet-PheRSα.M: 5000 bp DNA marker; 1: pCOLADuet-PheRSα; 2:pCOLADuet-PheRSα double digested with EcoR I/Hind III.(B)Recombinant plasmid pCOLADuet-PheRSαβ.M: 1 kb DNA marker; 1: pCOLADuet-PheRSαβ; 2: pCOLADuet-PheRSαβ digested with BamH I.

重組表達質(zhì)粒 pCOLADuet-PheRSαβ轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)RIPlL中，誘導優(yōu)化的結(jié)果表明，重組菌 E.coli [pCOLADuet-PheRSαβ]在 0.01 mmol/L IPTG誘導下誘導結(jié)果最明顯。因此表明重組菌在0.01 mmol/L IPTG誘導下、25℃過夜誘導的條件最佳。在此最佳誘導條件下，進行了蛋白的大量表達純化，圖5結(jié)果顯示α亞基(55 kDa)和β亞基(72 kDa)處均有誘導表達，與預期值相符。菌體裂解后的上清，采用His-Bind親和色譜柱進行了純化，SDS-PAGE分析洗脫結(jié)果后，從圖5中可以看出，通過親和層析純化后，可以得到高純度的重組融合蛋白。經(jīng)凝膠掃描分析，純度可達90%。

3.4 免疫印跡分析

為了進一步驗證純化后的目的蛋白，用免疫印跡對純化的蛋白樣品進行分析。因為融合蛋白中只有α亞基N端有His-Tag，因此用特異性抗His的一抗來進行進一步的鑒定時，只能出現(xiàn) α亞基大小的條帶。圖6結(jié)果顯示Mr在大約55 kDa處未誘導的菌液中沒有條帶，在IPTG誘導后有條帶出現(xiàn)，純化的蛋白樣品中也有特異性反應(yīng)條帶，進一步驗證了目的蛋白的正確性。

3.5 酶活性分析

目前還未見任何關(guān)于以布氏錐蟲PheRS為靶點的藥物篩選方法的建立，表達純化得到的PheRS必需在保證其有活性的基礎(chǔ)上，才能進行后續(xù)的藥物篩選工作。本實驗主要用放射性同位素方法來測定酶活性，圖7是20 μL反應(yīng)體積中的酶活性曲線。

圖5 SDS-PAGE分析純化的融合蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified fusion protein.M:protein marker; 1: E.coli [pCOLADuet- PheRSαβ]uninduced;2: E.coli [pCOLADuet-PheRSαβ]induced; 3: supernatant of induced E.coli [pCOLADuet- PheRSαβ]; 4: inclusion body of induced E.coli [pCOLADuet- PheRSαβ]; 5: co-purified α and β subunit.

圖6 重組PheRS蛋白的免疫印跡分析Fig.6 Western blotting analysis for recombinant PheRS.1: E.coli[pCOLADuet-PheRSαβ]uninduced; 2: E.coli [pCOLADuet-PheRSαβ]induced; 3: PheRS after purification(Only α subunit is shown for the lack of His-tag in β subunit).

圖7 放射性同位素法測定PheRS的活性Fig.7 Activity of PheRS measured in radioisotope method.

本實驗表達純化后得到的酶可以根據(jù)單位時間內(nèi)生成產(chǎn)物[14C]-Phe-tRNA的量來檢測其活性。70 μL總反應(yīng)體積中[14C]標記的苯丙氨酸[14C]-Phe的 CPM1值為 559440，經(jīng)[14C]標記的產(chǎn)物[14C]-Phe-tRNA產(chǎn)物的CPM2值為3580，背景放射CPM3為 80，初始底物[14C]-Phe 為 0.4662×10?6mmol，純化后的酶稀釋1000倍。根據(jù)公式計算出提純物每毫升酶單位(U/mL)為7。

根據(jù)以上結(jié)論說明通過本實驗的方法表達純化出的酶具有活性，因此可以將其作為化合物作用的靶標來篩選出抑制劑。

4 討 論

苯丙氨酰 tRNA合成酶是 AaRS中最復雜的一類酶。目前，已經(jīng)報道的PheRS的表達方法主要集中在以下幾種方法：例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PheRS的表達是通過將α亞基和 β亞基分別克隆入載體，再亞克隆入單啟動子操縱、雙核糖體結(jié)合位點的雙順反子表達載體后共表達[8]；人源性線粒體 PheRS直接克隆入表達載體后進行表達[9-10]；人源性細胞質(zhì)PheRS的α亞基和β亞基分別克隆入有標簽的表達載體，共轉(zhuǎn)化宿主菌進行表達[11-12]。經(jīng)同源性分析表明，布氏錐蟲的PheRS在同源性上與人源性PheRS最高，因此本實驗借鑒人源性細胞質(zhì)PheRS的質(zhì)粒構(gòu)建方法，在α亞基N端融合His標簽，β亞基N端和C端均沒有融合標簽；此外，采用了構(gòu)建重組共表達載體的方法代替了共轉(zhuǎn)化，簡化了實驗步驟。

原核生物Thermus thermophilus PheRS與同源tRNA復合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，這個異源四聚體事實上由兩個異源二聚體(αβ)組成，而一個四聚體結(jié)合兩個tRNA[13]。研究結(jié)果表明αβ異源二聚體由11個結(jié)構(gòu)域組成，其中A1～A3屬于α亞基，B1～B8屬于 β亞基。α亞基的結(jié)構(gòu)域具有催化模塊，一個螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域直接參與 tRNAPhe結(jié)合的氨酰化反應(yīng)；而由一系列結(jié)構(gòu)域組成的β亞基可能與其他蛋白一起發(fā)揮多重作用。整合入 β亞基的“類催化”模塊(B6、B7結(jié)構(gòu)域)、“類DNA結(jié)合”結(jié)構(gòu)域(B1和 B5)、“類 EMAPII”結(jié)構(gòu)域(B2，類似于 AspRS和LysRS的反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、“類SH-3”結(jié)構(gòu)域(B4，參與信號傳導過程)表明了PheRS酶的復雜的進化途徑。細胞質(zhì)PheRS在進化過程中，雖然在原核、真核生物中有差異，但也具有很高的保守性。在目前所有已知的物種中，細胞質(zhì)PheRS均以(αβ)2四聚體形式存在。這為在體外研究 T.Brucei PheRS的作用提供了依據(jù)。

PheRS由(αβ)2異源四聚體構(gòu)成，其活性位點主要位于α亞基，tRNA結(jié)合位點分布在α亞基和β亞基上，二者結(jié)構(gòu)完整時PheRS才能發(fā)揮其催化作用[14]。因此用同位素進行酶活性測定時是α亞基和β亞基形成的復合物的活性。用免疫印跡驗證純化出的蛋白時，選用抗α亞基N端His標簽的抗體，因此只顯示一條帶。在蛋白表達純化時的結(jié)果顯示在55 kDa(α亞基)和72 kDa(β亞基)處均有目的蛋白出現(xiàn)，并且在酶活性測定時通過放射性同位素方法測出了提純物每毫升酶單位(U/mL)為7。本研究首次成功表達純化得到了布氏錐蟲亮氨酰-tRNA合成酶，并對其進行了活性測定，這為以苯丙氨酰tRNA合成酶為靶點進行抗寄生蟲藥物篩選，為下一步構(gòu)建苯丙氨酰-tRNA合成酶藥物篩選模型，進而篩選對酶有抑制活性的化合物奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Cloning, expression, purification and activity assay of Trypanosoma brucei phenylalanyl-tRNA synthetase in Escherichia coli

Ying Yao, Guangwei Gao, and Dawei Li
School of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China

Received:August 7, 2009;Accepted:November 2, 2009

Corresponding author:Dawei Li.Tel: +86-21-34204744; Fax: +86-21-34205436; E-mail: daweili@sjtu.edu.cn