牛瘤胃分離菌株靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系生物轉(zhuǎn)化黃豆苷原

張琪，王秀伶，王世英，郝慶紅，郭云霞，王樹(shù)香

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071001

牛瘤胃分離菌株靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系生物轉(zhuǎn)化黃豆苷原

張琪，王秀伶，王世英，郝慶紅，郭云霞，王樹(shù)香

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071001

從牛瘤胃胃液中分離了一株在厭氧條件下能利用其生長(zhǎng)細(xì)胞將大豆異黃酮黃豆苷原高效還原為二氫黃豆苷原的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌菌株 Niu-O16。研究了菌株 Niu-O16靜息細(xì)胞體系轉(zhuǎn)化黃豆苷原的最佳轉(zhuǎn)化條件，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定菌株Niu-O16靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化黃豆苷原的最佳條件是：初始pH 6.0～8.0，靜息細(xì)胞濃度32～64 mg/mL(濕重)，加入底物濃度 0.8～1.2 mmol/L。通過(guò)正交試驗(yàn)確定了靜息細(xì)胞濃度、加入底物濃度及轉(zhuǎn)化時(shí)間的最佳組合為：靜息細(xì)胞濃度32 mg/mL、加入底物濃度0.8 mmol/L、轉(zhuǎn)化時(shí)間24 h；最佳轉(zhuǎn)化條件下底物轉(zhuǎn)化率最高為63.9%。該結(jié)果為厭氧菌的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化及工業(yè)應(yīng)用提供了參考。

牛瘤胃細(xì)菌，靜息細(xì)胞體系，黃豆苷原，二氫黃豆苷原，生物轉(zhuǎn)化

Abstract:In previous study we isolated a gram-positive bacterial strain, designated Niu-O16, from bovine rumen gastric juice.The growing cells of bacterial strain Niu-O16 is capable of biotransforming isoflavone daidzein into dihydrodaidzein efficiently under anaerobic conditions.In this study we investigated the optimal bioconversion conditions for the resting cells of bacterial strain Niu-O16 to convert daidzein into dihydrodaidzein.Single factor test showed that the optimal conditions for the initial pH of phosphate buffer, the concentration of the resting cell and the concentration of the substrate daidzein were 6.0–8.0, 32–64 mg/mL(wet weight)and 0.8–1.2 mmol/L, respectively.Orthogonal experiments were used to determine the optimal combination of the resting cell concentration, substrate concentration and biotransformation time.The results showed that the optimal combination included resting cell concentration 32 mg/mL, substrate concentration 0.8 mmol/L and the biotransformation time 24 h.Furthermore,the biotransformation kinetics under optimal conditions were studied, under which conditions the highest bioconversion rate was 63.9% in the resting cell system.The results might provide information for resting cell biotransforming of anaerobes as well as its industrial application.

Keywords:bovine rumen bacteria, resting cell system, daidzein, dihydrodaidzein, biotransformation

大豆異黃酮(Soy isoflavones)是大豆在其生長(zhǎng) 過(guò)程中形成的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中，其中含量最高的是黃豆苷(Daidzin)和染料木苷(Genistin)。體內(nèi)及體外試驗(yàn)均表明，攝入動(dòng)物體內(nèi)的大豆異黃酮糖苷，在腸道和肝組織中的β-葡萄糖苷酶作用下首先脫去糖苷，被水解為黃豆苷原(Daidzein)和染料木黃酮(Genistein)。其后，在胃腸道微生物菌群作用下又進(jìn)一步被降解為各種不同的大豆異黃酮代謝產(chǎn)物。其中黃豆苷原可被降解為二氫黃豆苷原(Dihydrodaidzein，簡(jiǎn)稱DHD)、四氫黃豆苷原(Tetrahydrodaidzein，簡(jiǎn)稱 THD)、去氧甲基安哥拉紫檀素(O-Desmethylangolensin，簡(jiǎn)稱O-Dma)和雌馬酚(Equol)[1-4]等不同代謝產(chǎn)物。

大量流行病學(xué)研究證實(shí)，大豆異黃酮能明顯降低與性激素相關(guān)疾病如乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌等的發(fā)病率，預(yù)防骨質(zhì)疏松，有效緩解婦女更年期綜合癥；此外，大豆異黃酮還能降低心腦血管發(fā)病率及抗氧化、抗溶血、抗真菌等生物學(xué)功能[5-8]。最新研究表明大豆異黃酮代謝產(chǎn)物具有比大豆異黃酮更高更廣的生物學(xué)活性。近年來(lái)有關(guān)大豆異黃酮黃豆苷原代謝產(chǎn)物 DHD生物學(xué)功能方面也屢見(jiàn)報(bào)道。DHD是保持血管活性的成分之一，由于它與17β-雌二醇的結(jié)構(gòu)相似，從而能有效地抑制血管收縮，防止內(nèi)皮組織受傷害。Chin-Dusting等[9]、Jiang等[10]分別分析比較了黃豆苷原及化學(xué)合成的黃豆苷原不同代謝產(chǎn)物對(duì)心腦血管的保護(hù)作用，研究結(jié)果均表明 DHD對(duì)心腦血管的保護(hù)作用遠(yuǎn)高于其親本化合物黃豆苷原。此外，DHD是合成高活性植物雌激素雌馬酚的第一個(gè)重要中間產(chǎn)物，目前能將DHD特定轉(zhuǎn)化為雌馬酚的稀有微生物菌株 Eggerthella Julong732(AY310748)已經(jīng)從人體腸道微生物菌群中分離出來(lái)[11]，因此，DHD可作為雌馬酚微生物生物合成的直接原料。

盡管目前 DHD可利用化學(xué)氫轉(zhuǎn)移法進(jìn)行人工合成，但生成的大量副產(chǎn)物給分離純化造成困難，加之所用化學(xué)催化劑昂貴，目前化學(xué)合成的DHD國(guó)際市場(chǎng)售價(jià)較高(美國(guó) Lclabs)。微生物生物轉(zhuǎn)化是利用微生物產(chǎn)生的酶作用于化合物的特定部位，使它轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)相似但具有更大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新化合物的過(guò)程。微生物轉(zhuǎn)化既可用生長(zhǎng)細(xì)胞完成又可用靜息細(xì)胞來(lái)完成。靜息細(xì)胞是有生命、很少或不分裂、保持許多酶活性的細(xì)胞。靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是在菌體培養(yǎng)到一定時(shí)間，用過(guò)濾或離心方法進(jìn)行分離，收集菌體，將其懸浮于緩沖液或不完全培養(yǎng)基中，加入底物，在一定溫度、pH和振蕩條件下進(jìn)行的轉(zhuǎn)化方法[12-14]。與生長(zhǎng)細(xì)胞相比，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法可自由改變轉(zhuǎn)化體系中底物和菌體比例，提高轉(zhuǎn)化效率。另外，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化中產(chǎn)物的雜質(zhì)較少。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道過(guò)一株篩自牛瘤胃胃液的能將黃豆苷原還原為 DHD 的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌菌株 Niu-O16(AY263505)，并對(duì)其生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化研究[15]。

本研究首次嘗試?yán)门Ａ鑫阜蛛x菌株 Niu-O16靜息細(xì)胞體系生物轉(zhuǎn)化黃豆苷原，對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適于牛瘤胃分離菌株Niu-O16轉(zhuǎn)化的最佳靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

菌種：Niu-O16(本實(shí)驗(yàn)室保藏)。培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為腦心浸液(Brain heart infusion，簡(jiǎn)稱BHI)，購(gòu)自美國(guó)Bacto公司。底物：黃豆苷原(Daidzein)，購(gòu)自美國(guó)Indofine公司。菌株培養(yǎng)裝置：Concept 400 厭氧工作站(英國(guó)Ruskinn)，工作站內(nèi)氣體種類及配比為 5% CO2、10% H2和85% N2。檢測(cè)裝置：HPLC 系統(tǒng)(美國(guó) Waters)，1525型雙泵，2487UV檢測(cè)器，Kromasil C18分析色譜柱(5 μm，250 mm × 4.6 mm)。離心裝置：Eppendorf 5417R低溫高速離心機(jī)(德國(guó))。蒸干裝置：DK-VC010-IR 真空離心濃縮儀(韓國(guó)DAIKI)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

從?80℃冰箱中取出菌株凍存液，接種于1 mL的種子培養(yǎng)基中，接種量為10%；37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后再次轉(zhuǎn)接于1 mL種子培養(yǎng)基中，接種量為5%，37℃恒溫培養(yǎng)18～20 h，此時(shí)得到的菌懸液可作為種子。

1.2.2 菌體制備、收集及培養(yǎng)

參考 Masata M等[16]的方法加以改良。將種子以5%的接種量接種于盛有1 mL BHI的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃下厭氧培養(yǎng) 18～20 h；在厭氧工作站內(nèi)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入已滅菌的1.5 mL離心管中，將離心管取出厭氧工作站，4℃、12 000 r/min離心5 min，放回厭氧工作站后棄上清，收集菌體；加入0.05 moL/L pH 6.0的磷酸緩沖液，定容至1 mL，制成不同濃度的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，在厭氧工作站內(nèi)靜置培養(yǎng)。

1.2.3 靜息細(xì)胞培養(yǎng)基成分的篩選

向靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中添加適量的糖、氮源、氨基酸、尿素及金屬離子等成分可控制菌體維持最低限度生命活動(dòng)及合成某一特定代謝產(chǎn)物[17-19]。日本學(xué)者 Nagasawa等發(fā)現(xiàn)在熒光假單胞菌靜息細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入煙酸可誘導(dǎo)羥基化酶的形成[20]。因此參考相關(guān)信息，向靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加葡萄糖、L-半胱氨酸、尿素和硫酸銨等成分，研究其對(duì)牛瘤胃菌株Niu-O16轉(zhuǎn)化的影響。

1.2.4 不同靜息細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)化體系的建立

將牛瘤胃分離菌株按 5%接種量接種于 1 mL BHI培養(yǎng)基中，在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)18～20 h后離心收集菌體于1.5 mL離心管中，管內(nèi)菌體平均濕重為8 mg，向該離心管內(nèi)加入1 mL pH 6.0的磷酸緩沖液定為 1倍(1×)靜息細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)化體系；將兩個(gè)離心管內(nèi)菌體合并后加入1.0 mL pH 6.0的磷酸緩沖液定為 2倍(2×)靜息細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)化體系，依次建立 4 倍(4×)、6倍(6×)和 8 倍(8×)的不同靜息細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)化體系。

1.2.5 高效液相檢測(cè)

轉(zhuǎn)化結(jié)束后，取 100 μL靜息細(xì)胞培養(yǎng)液置于1.5 mL離心管中，加入1.0 mL乙酸乙酯萃取1次，取上清在真空離心濃縮儀中蒸干，100%甲醇溶解后用HPLC檢測(cè)底物黃豆苷原被轉(zhuǎn)化情況。檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流動(dòng)相為乙腈和水，具體方法見(jiàn)Wang等[15]的報(bào)道。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立

菌株Niu-O16在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)后離心獲靜息細(xì)胞，按8 mg/mL的比例懸浮于滅菌試管中，懸浮液為0.05 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液，加入底物黃豆苷原 0.1 mmol/L，在厭氧工作站內(nèi) 37℃反應(yīng)48 h后萃取，并用HPLC檢測(cè)底物被轉(zhuǎn)化情況。向磷酸緩沖液(8#)中添加了一定濃度的葡萄糖、L-半胱氨酸、尿素和硫酸銨，組成不同靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系，其轉(zhuǎn)化效率見(jiàn)表1。

表1 靜息細(xì)胞培養(yǎng)基組分及相關(guān)轉(zhuǎn)化結(jié)果Table 1 Nutrient components of resting cell system and the correlated biotransformation

從表 1可以看出，向磷酸緩沖液靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加不同營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)菌體的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化均無(wú)明顯影響，因此本研究直接選用磷酸緩沖液作為菌株Niu-O16的靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其他轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

2.2 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.2.1 不同初始pH值對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

不同 pH值會(huì)改變酶活性及與之相關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)[21]。處于培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)細(xì)胞在一定范圍內(nèi)可通過(guò)其生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝物改變培養(yǎng)基初始pH；靜息細(xì)胞則不同，在靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系中，菌體本身不能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)繁殖，只能被動(dòng)處于初始培養(yǎng)體系的pH下，如果初始pH對(duì)轉(zhuǎn)化酶系活性影響較大，則該初始pH將直接影響靜息細(xì)胞對(duì)底物的轉(zhuǎn)化效率。本研究表明，靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系的初始pH過(guò)高或過(guò)低均不利于 Niu-O16菌體對(duì)底物黃豆苷原的轉(zhuǎn)化。初始pH為4.5時(shí)，轉(zhuǎn)化體系中只生成極少量DHD；當(dāng)初始pH接近中性，即初始pH在6.0～8.0之間時(shí)底物轉(zhuǎn)化率最高(圖1)，這與菌體 Niu-O16生長(zhǎng)細(xì)胞在不同初始pH下的BHI培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化結(jié)果基本一致[15]。

圖1 不同靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系初始 pH對(duì)牛瘤胃菌株Niu-O16轉(zhuǎn)化黃豆苷原的影響Fig.1 Effect of initial pH conditions on the biotransformation of daidzein in bovine rumen bacterial strain Niu-O16.Resting cell concentration: 1×, substrate concentration: 0.1 mmol/L.

2.2.2 靜息細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

菌體對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率不僅與單個(gè)菌體細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化酶活力大小有關(guān)，而且與單位體積內(nèi)的菌體數(shù)量即菌體濃度有關(guān)。與生長(zhǎng)細(xì)胞相比，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法可通過(guò)提高轉(zhuǎn)化體系內(nèi)的細(xì)胞濃度來(lái)提高底物轉(zhuǎn)化率。參考菌株Niu-O16生長(zhǎng)細(xì)胞能轉(zhuǎn)化黃豆苷原的最大底物濃度[15]，向不同濃度靜息細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入 1.2 mmol/L的底物黃豆苷原，在37℃厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng) 48 h，乙酸乙酯萃取后加入100%甲醇進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化體系中的不同靜息細(xì)胞濃度對(duì)底物轉(zhuǎn)化有明顯影響。當(dāng)細(xì)胞濃度為1×～4×?xí)r，生成的DHD的量隨細(xì)胞濃度增加而增加。然而，當(dāng)靜息細(xì)胞濃度超過(guò)4×?xí)r，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中底物黃豆苷原的剩余量及產(chǎn)物 DHD的生成量均有所降低，尤其當(dāng)靜息細(xì)胞濃度增大到8×?xí)r，這種剩余底物量及生成的 DHD的量其下降趨勢(shì)變得更為明顯(圖2)。造成這一現(xiàn)象的原因可能是：牛瘤胃分離菌株產(chǎn)生的能將黃豆苷原還原為 DHD的還原酶是胞內(nèi)酶，加入到轉(zhuǎn)化體系中的底物首先要進(jìn)入到細(xì)菌靜息細(xì)胞體內(nèi)，在菌體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為DHD后再被排出到靜息細(xì)胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)處于一種動(dòng)態(tài)平衡中。當(dāng)轉(zhuǎn)化體系中的靜息細(xì)胞濃度過(guò)高時(shí)，殘存在靜息細(xì)胞中的底物及產(chǎn)物不能被乙酸乙酯有效萃取出來(lái)，致使未被轉(zhuǎn)化的底物黃豆苷原濃度與生成的產(chǎn)物 DHD之和明顯小于反應(yīng)前加入的底物黃豆苷原總量。

2.2.3 不同底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

分別向4×靜息細(xì)胞濃度的轉(zhuǎn)化體系中加入0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L的底物黃豆苷原，在厭氧工作站內(nèi)37℃反應(yīng)48 h，乙酸乙酯萃取后用HPLC檢測(cè)。研究結(jié)果表明，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.4～0.8 mmol/L時(shí)，生成的產(chǎn)物 DHD隨加入底物黃豆苷原的增加而增加，底物濃度為0.8 mmol/L時(shí)，菌體對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高(57.9%)；當(dāng)?shù)孜餄舛仍鲋?.2 mmol/L時(shí)，生成的DHD量與加入0.8 mmol/L底物時(shí)相比并無(wú)明顯增加；當(dāng)加入的底物濃度增大到1.6 mmol/L時(shí)，大部分底物不能被轉(zhuǎn)化(圖3)。

圖2 不同靜息細(xì)胞濃度對(duì)牛瘤胃菌株Niu-O16轉(zhuǎn)化黃豆苷原的影響Fig.2 Effect of different resting cell concentrations on the biotransformation of daidzein in bovine rumen bacterial strain Niu-O16.

圖3 不同底物濃度對(duì)牛瘤胃菌株Niu-O16靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化黃豆苷原的影響Fig.3 Effect of different substrate concentrations on the biotransformation of daidzein in bovine rumen bacterial strain Niu-O16.

由于靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法可自由改變體系中底物和菌體的濃度，其轉(zhuǎn)化效率理論上會(huì)明顯高于生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。Yi等[22]利用新月彎孢霉研究甾體轉(zhuǎn)化時(shí)也發(fā)現(xiàn)，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法顯著高于發(fā)酵液中生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。然而，本研究中 4倍細(xì)胞濃度的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力卻與 1倍生長(zhǎng)細(xì)胞相近。以往利用菌株Niu-O16的生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，加入到BHI培養(yǎng)基中的底物黃豆苷原濃度在0.4～0.8 mmol/L時(shí)，菌株 Niu-O16的生長(zhǎng)細(xì)胞幾乎能全部將其轉(zhuǎn)化為DHD；當(dāng)?shù)孜餄舛仍?1.0～1.2 mmol/L時(shí)，Niu-O16生長(zhǎng)細(xì)胞亦能將加入的大部分底物黃豆苷原轉(zhuǎn)化為DHD[15]。本研究中，當(dāng)加入到Niu-O16靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中的底物濃度超過(guò)0.8 mmol/L時(shí)，底物的轉(zhuǎn)化率呈明顯下降趨勢(shì)，這可能是由于底物黃豆苷原對(duì)菌體具有毒性。以往測(cè)定菌株 Niu-O16生長(zhǎng)曲線時(shí)曾發(fā)現(xiàn)，接菌后同時(shí)加入0.1 mmol/L的底物黃豆苷原導(dǎo)致延滯期延長(zhǎng)6 h[15]。本研究中，0.8 mmol/L的底物黃豆苷原對(duì)Niu-O16靜息細(xì)胞造成的毒性可能遠(yuǎn)高其生長(zhǎng)細(xì)胞，進(jìn)而影響Niu-O16靜息細(xì)胞大量分泌能將底物黃豆苷原轉(zhuǎn)化為二氫黃豆苷原的還原酶及輔酶，最終導(dǎo)致靜息細(xì)胞還原能力的下降。此外，牛瘤胃分離菌株Niu-O16為嚴(yán)格厭氧菌株，無(wú)論靜息細(xì)胞還是生長(zhǎng)細(xì)胞都必須在厭氧條件下才能有效完成轉(zhuǎn)化過(guò)程。然而，靜息細(xì)胞離心過(guò)程需在厭氧工作站外完成。盡管離心時(shí)間僅有5 min，但這很可能足以使大部分Niu-O16菌株發(fā)生“氧中毒”，當(dāng)離心完成放回厭氧工作站后，仍不能正常發(fā)揮其轉(zhuǎn)化能力，最終導(dǎo)致4倍用量細(xì)胞的實(shí)際轉(zhuǎn)化能力反而不如 1倍的生長(zhǎng)體系的細(xì)胞，這很可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降的主要原因。

2.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響轉(zhuǎn)化的因素很多，其中包括靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系初始pH、靜息細(xì)胞濃度、加入底物濃度以及轉(zhuǎn)化時(shí)間等。通過(guò)單因素試驗(yàn)已確定菌株Niu-O16高效轉(zhuǎn)化的最適pH值范圍，且在此最適pH范圍內(nèi)，靜息細(xì)胞濃度及底物濃度等因素對(duì)轉(zhuǎn)化的影響不受pH變化的干擾。因此，選定靜息細(xì)胞濃度(mg/mL)、底物濃度(mmol/L)和不同轉(zhuǎn)化時(shí)間(h)3種因素，采用正交表L9(33)[23]對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行綜合考察，研究其對(duì)生物合成DHD的影響。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出，靜息細(xì)胞濃度對(duì)DHD生物合成影響最大，其次為轉(zhuǎn)化時(shí)間和所加底物濃度，主次因素為RB＞RA＞RC，理論最優(yōu)組合為A2B2C2。然而，組合A2B2C2并未出現(xiàn)在表3的9個(gè)試驗(yàn)組中，9個(gè)試驗(yàn)組中的最佳組合為A2B2C3(5#)。組合A2B2C2與組合A2B2C3的唯一差異在于所加底物濃度的不同。在組合A2B2C2中，加入底物黃豆苷原濃度為0.8 mmol/L，而組合A2B2C3中加入底物濃度為1.2 mmol/L。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，底物濃度為 1.2 mmol/L時(shí)，產(chǎn)物DHD的生成量與底物濃度為 0.8 mmol/L時(shí)基本相同，但從轉(zhuǎn)化率上看，加入底物濃度為0.8 mmol/L時(shí)的轉(zhuǎn)化率明顯更高些。因此，通過(guò)本研究選定的最佳組合為A2B2C2。正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 靜息細(xì)胞初始轉(zhuǎn)化條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment on the resting cell incipient transformation condition

F0.05(2，10)= 4.10，F(xiàn)0.01(2，10)= 7.56，而 FA、FB均大于7.56，表明A、B兩因素對(duì)生物合成DHD均有顯著性影響。其中靜息細(xì)胞濃度對(duì)底物黃豆苷原轉(zhuǎn)化的影響最為顯著，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格控制靜息細(xì)胞濃度。

2.3 最佳轉(zhuǎn)化條件下的轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)

將牛瘤胃菌株 Niu-O16制備成靜息細(xì)胞，按32 mg/mL懸浮于滅菌試管中，加入0.8 mmol/L底物，每隔0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h分別取樣檢測(cè)，測(cè)定底物黃豆苷原在菌株Niu-O16靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中的轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

圖4 牛瘤胃菌Niu-O16最佳靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系對(duì)底物黃豆苷原的轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)Fig.4 Biotransformation kinetics of daidzein by bovine rumen bacterial strain Niu-O16 under optical resting cell biotransformation system.

由圖4可以看出，將底物加入到Niu-O16靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系后的24 h內(nèi)，底物黃豆苷原濃度呈直線下降，產(chǎn)物DHD呈直線上升；此后，隨轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng)，底物和產(chǎn)濃度變化不明顯。通過(guò)比較牛瘤胃菌株Niu-O16的生長(zhǎng)細(xì)胞[15]和靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中，底物黃豆苷原被轉(zhuǎn)化為DHD的速度有所加快。

3 結(jié)論

菌株Niu-O16(AY263505)是從牛瘤胃胃液分離的能將黃豆苷原高效還原為二氫黃豆苷原的嚴(yán)格厭氧細(xì)菌菌株，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)菌株Niu-O16靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化黃豆苷原進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在厭氧和適宜的pH條件下，細(xì)菌菌株Niu-O16靜息細(xì)胞能將底物黃豆苷原有效還原為二氫黃豆苷原；分別通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究了初始pH條件、靜息細(xì)胞濃度、加入底物濃度及轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化體系中的靜息細(xì)胞濃度和轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率均有顯著影響，其中靜息細(xì)胞濃度對(duì)菌株Niu-O16轉(zhuǎn)化黃豆苷原的影響尤為顯著。在厭氧條件下，32 mg/mL靜息細(xì)胞濃度制備成靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，加入0.8 mmol/L底物黃豆苷原，反應(yīng)24 h時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，摩爾轉(zhuǎn)化率為63.9%。

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Biotransformation of daidzein by resting cell system of bacterial strain isolated from bovine rumen gastric juice

Qi Zhang, Xiuling Wang., Shiying Wang, Qinghong Hao, Yunxia Guo, and Shuxiang Wang
College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China

Received:May 16, 2009;Accepted:November 19, 2009

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.30570035, 30770047).

Corresponding author:Xiuling Wang.Tel: +86-312-7528257; E-mail: wxling2000@hebau.edu.cn國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.30570035, 30770047)資助。