H3N2型豬流感病毒M2蛋白表達(dá)分析

王曉杜，陳培君，沈陽，邱亞峰，鄧緒芳，史子學(xué)，彭麗娜，羅金燕，劉超，馬志永

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

H3N2型豬流感病毒M2蛋白表達(dá)分析

王曉杜，陳培君，沈陽，邱亞峰，鄧緒芳，史子學(xué)，彭麗娜，羅金燕，劉超，馬志永

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

流感病毒的M2蛋白在流感病毒復(fù)制中起著重要作用，是抗流感病毒的靶標(biāo)分子。本研究以提取的病毒基因組RNA作為模板，RT-PCR擴(kuò)增H3N2亞型豬流感病毒M2基因，分別構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體和重組真核表達(dá)載體，建立了M2蛋白的原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，制備了M2重組蛋白，并免疫大鼠制備了多克隆抗體。Western blotting和間接免疫熒光方法檢測表明所制備的抗體能識(shí)別真核表達(dá)的M2蛋白和病毒感染細(xì)胞后表達(dá)M2蛋白，具有良好的特異性。重組M2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，表達(dá)的重組M2蛋白大小為20 kDa，定位于細(xì)胞漿中，與病毒感染細(xì)胞中的M2蛋白定位相同。Western blotting檢測表明M2蛋白在病毒感染細(xì)胞12 h后才能檢出，晚于NS1、NP和M1，屬于病毒復(fù)制的晚期蛋白，可作為病毒復(fù)制晚期的指示分子。本研究為弄清M2蛋白在病毒復(fù)制過程中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

H3N2，豬流感病毒，M2蛋白，多克隆抗體

Abstract:M2 protein of influenza A virus is encoded by a spliced mRNA derived from RNA segment 7 and plays an important role in influenza virus replication.It is also a target molecule of anti-virus drugs.We extracted the viral genome RNAs from MDCK cells infected with swine influenza A virus(SIV)H3N2 subtype and amplified the SIV M2 gene by reverse transcriptase-polymerase chain reaction using the isloated viral genome RNAs as template.The amplified cDNA was cloned into a prokaryotic expression vector pET-28a(+)(designated pET-28a(+)-M2)and a eukaryotic expression vector p3xFLAG-CMV-7.1(designated p3xFLAG-CMV-7.1-M2), respectively.The resulted constructs were confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing analysis.We then transformed the plasmid pET-28a(+)-M2 into Escherichia coli BL21(DE3)strain and expressed it by adding 1 mmol/L of IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside).The recombinant M2 protein was purified from the induced bacterial cells using Ni2+affinity chromatography.Wistar rats were immunized with the purified M2 protein for producing polyclonal antibodies specific for it.Western blotting analysis and immunofluorescence analysis showed that the produced antibodies were capable of reacting with M2 protein expressed in p3xFLAG-CMV-7.1-M2-transfected cells as well as that synthesized in SIV-infected cells.We also transfected plasmid p3xFLAG-CMV-7.1-M2 into Vero cells and analyzed its subcellular localization by immunofluorescence.The M2 protein expressed in the Vero cells was 20 kDa in size and dominantly localized in the cytoplasm, showing a similar distribution to that in SIV-infected cells.Western blotting analysis of SIV-infected cells suggested that M2 was a late phase protein,which was detectable 12 h post-infection, later than NS1, NP and M1 proteins.It would be a potential molecular indicator of late phases replication of virus.Our results would be useful for studying the biological function of M2 protein in SIV replication.

Keywords:swine influenza virus, H3N2 subtype, M2 protein, gene expression

近年來流感病毒給人類帶來巨大災(zāi)難，特別是高致病性禽流感不僅給雞群帶來毀滅性打擊，也給人類帶來了生命的威脅。而豬作為人、禽流感的混合器，在獸醫(yī)公共衛(wèi)生方面具有重要的研究意義，豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來重要影響，也可能給人類帶來威脅，最近爆發(fā)于墨西哥的甲型 H1N1病毒就是來源于豬流感病毒形成的三元重配病毒，給人類帶來了巨大災(zāi)難[1]，因此，研究豬流感病毒的發(fā)病機(jī)理就顯得尤為重要，同時(shí)也可為人流感的防控提供一些依據(jù)。

流感病毒是由 8個(gè)基因組 RNA組成的負(fù)鏈病毒，目前已知編碼11種蛋白。M2蛋白單體由流感病毒基因組片段7編碼的97個(gè)氨基酸組成，包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：暴露在外面的N端24個(gè)氨基酸，跨膜區(qū)的19個(gè)疏水氨基酸和C端朝向病毒內(nèi)部的54個(gè)氨基酸。流感病毒的 M2蛋白是一種整合在病毒殼膜上的離子通道蛋白，它們形成同源四聚體的離子通道，每個(gè)單元之間是通過二硫鍵相連，離子通道能被低的pH值所激活。在流感病毒復(fù)制中，病毒HA蛋白與受體結(jié)合，隨著細(xì)胞的內(nèi)吞作用，在胞內(nèi)形成內(nèi)噬體，暴露在低pH下的M2蛋白形成離子通道，H+進(jìn)入病毒粒子內(nèi)，HA蛋白構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)換并且與膜發(fā)生融合，打開病毒粒子的殼膜，低 pH值減弱M1和RNP蛋白之間的相互作用，釋放RNP進(jìn)入細(xì)胞核[2-4]，所以M2蛋白在病毒入侵中起到關(guān)鍵作用。金剛烷胺抗流感病毒藥物就是利用此功能，抑制離子通道的產(chǎn)生，從而抑制流感病毒的復(fù)制。最近研究報(bào)道了M2蛋白跨膜區(qū)的2個(gè)不同結(jié)構(gòu)的高清晰圖片，揭示了抗流感病毒藥物金剛烷胺的綁定位點(diǎn)[5-6]。金剛烷胺既能影響所有A型流感病毒的脫殼[7-8]，也能在另外一些亞型流感病毒復(fù)制的晚期，通過阻止病毒的包裝和出芽抑制其復(fù)制[9]。流感病毒 M2作為抗病毒藥物靶標(biāo)，盡管金剛烷胺的作用機(jī)制已經(jīng)清楚，但是在臨床中具有較強(qiáng)的副作用，因此研究以M2蛋白為靶標(biāo)分子的新型抗病毒藥物，為防治流感的大爆發(fā)做好準(zhǔn)備工作是至關(guān)重要的。

流感病毒M2蛋白在病毒復(fù)制中具有重要作用，又是抗病毒研究的重要靶標(biāo)分子，本研究利用分子生物學(xué)方法，克隆了 H3N2亞型豬流感病毒的 M2基因，分別構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體和重組真核表達(dá)載體，制備了其特異性抗體，分析了 M2的表達(dá)特性，為M2蛋白的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬流感病毒(A/Swine/Jiangsu/2/2006(H3N2))、大腸桿菌DH5α和BL21、Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a(+)、真核表達(dá)質(zhì)粒p3xFLAG-CMV-7.1由本室保存。Wistar大鼠購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

AMV反轉(zhuǎn)錄酶、PCR擴(kuò)增用Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T載體試劑盒購自寶生物公司；質(zhì)粒抽提和DNA片段回收試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)公司；His band凝膠純化柱購于Novagen公司；弗氏佐劑購于 Sigma公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于Invitrogen公司；DMEM和胎牛血清購于Gibco公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗大鼠 IgG、TFITC標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG、FITC標(biāo)記的羊抗大鼠IgG購自Santa Cruz公司；ECL發(fā)光試劑盒購于Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆與原核表達(dá)

流感病毒感染MDCK細(xì)胞12 h后，提取細(xì)胞總RNA，利用olig(d)T作為反轉(zhuǎn)錄引物，AMV酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，M2基因編碼區(qū)引物：上游5'-TATGAA TTCATGAGCCTTCTAACCG-3'; 下游5'-CGCGTCG ACTTACTCCAGCTCTATGTT-3', RT-PCR擴(kuò)增獲得一個(gè)約300 bp的產(chǎn)物。EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切亞克隆到pET-28a(+)載體上，構(gòu)建pET-28a(+)-M2重組表達(dá)載體。

pET-28(a)-M2重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)后，1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo) 3 h，15%SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，篩選陽性克隆。

1.2.2 原核表達(dá)產(chǎn)物的純化與免疫

上述鑒定好的克隆菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)。參照Marshak等[10]的方法提取包涵體，利用His-Band Ni+柱進(jìn)行親和層析純化，SDS-PAGE檢測純化效果，純化后M2蛋白免疫Wistar大鼠(100 μg/只)，第一次采用弗氏完全佐劑(1:1)，后面免疫采用弗氏不完全佐劑每2周免疫1次，連續(xù)免疫5次。乙醚麻醉后心臟采血，收集血清。

1.2.3 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和重組蛋白真核表達(dá)

利用上游引物 5'-TATGAATTCGATGAGCCTT CTAACCG-3'和下游引物 5'-CGCGTCGACTTACT CCAGCTCTATGTT-3'，以質(zhì)粒 pET-28a(+)-M2為模板 PCR擴(kuò)增，亞克隆該片段到真核表達(dá)質(zhì)粒p3xFLAG-CMV-7.1上，EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定陽性克隆。陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，利用大提試劑盒，提取高純度的重組質(zhì)粒p3xFLAG-CMV-7.1-M2。

根據(jù)試劑盒說明書上的方法，利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p3xFLAG-CMV-7.1-M2到單層Vero細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h收取細(xì)胞樣品，BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度。

收集樣品進(jìn)行15%凝膠SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，室溫封閉 2 h后，適當(dāng)比例稀釋的一抗室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗5次，添加ECL發(fā)光試劑盒底物，暗室曝光膠片顯色。

1.2.4 M2多克隆抗體的效價(jià)和特異性檢測

采用間接ELISA方法檢測其效價(jià)，利用原核表達(dá)產(chǎn)物包被ELISA板，將收集到的血清按不同稀釋度加入孔內(nèi)，37℃作用1 h，PBST漂洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗37℃作用1 h，漂洗5次后，加入TMB底物避光顯色30 min，然后在酶標(biāo)儀上450 nm測定OD值。

5個(gè)MOI(Multiple of infection，多重感染復(fù)數(shù))的H3N2豬流感病毒接種Vero細(xì)胞，37℃孵育1 h，棄上清，更換含有TPCK胰酶的DMEM維持液，不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞樣品，裂解細(xì)胞樣品后，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。然后利用上述方法，Western blotting檢測病毒表達(dá)的M2蛋白和其他病毒蛋白。

Vero細(xì)胞生長在蓋玻片上，按照上述方法轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒和接種病毒，24 h后，去除上清，PBS洗滌3次，加入固定液(4%甲醛：10%甲醇)固定20 min，PBS洗滌 3次，37℃下用 1% NP40處理30 min，PBS洗滌3次，10%羊血清37℃封閉30 min，PBS洗滌3次，適當(dāng)比例的一抗37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，熒光標(biāo)記的二抗37℃孵育30 min，TBS洗滌3次，DAPI室溫染色10 min，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察蛋白的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 M2基因的克隆和原核、真核表達(dá)載體的構(gòu)建

SIV的M2基因是流感病毒片段 7的剪切體，RT-PCR擴(kuò)增出大約300 bp的片段(圖1a)，經(jīng)DNA序列分析，所克隆的 M2基因的開放閱讀框架為294 bp，編碼97個(gè)氨基酸，與A/swine/Shandong/nc/2005(H9N2)和 A/chicken/Jiangsu/wa/2002(H9N2)同源性分別高達(dá) 100%和 97%。將該片段純化回收后，亞克隆到 pET-28a(+)載體上，構(gòu)建 pET-28a(+)-SIV-M2重組原核表達(dá)載體，PCR、酶切和測序鑒定獲得陽性克隆(圖1b)。將該片段亞克隆到真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-7.1上，獲得p3xFLAG-CMV-7.1-SIV-M2重組真核表達(dá)載體，酶切鑒定和測序鑒定獲得陽性克隆(圖1c)。

2.2 原核表達(dá)及純化

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28 a(+)-M2轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)中，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo) 3 h后收樣，SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示 M2蛋白得到較好表達(dá)，分子量大小為20 kDa左右。該陽性克隆菌株經(jīng)大量培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后，得到包涵體沉淀，然后利用Novegen公司的His-band親和層析柱純化所得重組蛋白，純化后經(jīng)SDS-PAGE分析，顯示 M2蛋白純化效果較好(圖2)，獲得了比較純的抗原以進(jìn)一步制備抗體。

圖1 SIV的M2基因克隆和原核、真核表達(dá)重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of swine influenza virus M2 gene and restricted enzymes digestion of pET-28a(+)-M2 and p3xFLAG-CMV-7.1-SIV-M2 plasmid.(a)PCR amplification of swine influenza virus M2 gene.M: DL2000 marker; 1: M2 PCR production.(b)Restricted enzymes digestion of pET-28a(+)-M2 plasmid.M: DL2000, 1 kb marker; 1: enzymes digestion of pET-28a(+)-M2; 2: enzymes digestion of pET-28a(+).(c)Restricted enzymes digestion of p3xFLAG-CMV-7.1-SIV-M2 plasmid.M: 1 kb, DL2000 marker; 1: enzymes digestion of p3xFLAG-CMV-7.1-SIV-M2; 2: PCR production of swine influenza virus M2 gene.

圖2 SDS-PAGE檢測pET-28a(+)-M2的表達(dá)及純化Fig.2 SDS-PAGE of inclusion bodies(pET-28a(+)-M2)and purification.M: protein marker; 1: lysate of BL21(pET-28a(+))inducing by IPTG; 2: lysate of BL21 without inducing; 3: lysate of BL21(pET-28a(+)-M2)inducing by IPTG; 4: cracked supernatant BL21(pET-28a(+)-M2); 5?7: purification of inclusion bodies pET-28a(+)-M2.

2.3 抗M2抗體制備和特異性分析

2.3.1 抗M2抗體ELISA效價(jià)檢測

高純度的重組M2蛋白免疫Wistar大鼠，重復(fù)5次免疫后麻醉心臟采血，制備抗M2蛋白的抗血清。以原核表達(dá)的重組蛋白按適當(dāng)濃度(10?50 μg/mL)包被酶標(biāo)板，間接ELISA方法檢測所制備血清效價(jià)，結(jié)果顯示ELISA效價(jià)為1∶12 800，該抗體具有較高的效價(jià)。

2.3.2 Western blotting檢測真核表達(dá)及抗體特異性

M2基因亞克隆到p3xFLAG-CMV-7.1真核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000按說明書上的方法，轉(zhuǎn)染 2 μg重組質(zhì)粒 p3xFLAG-CMV-7.1-M2至 Vero細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染 p3xFLAG-CMV-7.1和p3xFLAG-CMV-7.1-M1[11]作為對(duì)照，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣品，進(jìn)行Western blotting檢測，一抗先用M2抗體(1：1000)顯色，顯色完成后進(jìn)行剝離，去掉一抗，然后加入抗FLAG標(biāo)簽的抗體，ECL發(fā)光試劑盒顯色，顯色結(jié)果見圖3。所制備的抗體能識(shí)別M2蛋白，但不識(shí)別M1，表明具有良好的特異性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，使用流感病毒感染細(xì)胞樣品檢驗(yàn)了所制備抗體的特異性，如圖4所示，流感病毒感染細(xì)胞樣品檢測到 M2蛋白，而對(duì)照沒有，表明所制備抗體的特異性良好，可用于M2蛋白的研究。

2.4 病毒感染Vero細(xì)胞M2蛋白表達(dá)

5個(gè)MOI流感病毒感染Vero細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，同時(shí)設(shè)定未感染對(duì)照，收集細(xì)胞樣品，Western blotting分析M2蛋白表達(dá)的時(shí)空變化，并與病毒的 NS1、NP、M1蛋白進(jìn)行了比較。如圖4所示，M2蛋白在感染12 h才可被檢測到，其出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)晚于病毒的 NS1、NP、M1蛋白，可以作為病毒復(fù)制的中后期標(biāo)志蛋白。

2.5 間接免疫熒光檢測M2蛋白亞細(xì)胞定位

圖3 重組流感病毒M2蛋白真核表達(dá)及其抗體特異性Fig.3 Eukaryotic expression of p3xFLAG-CMV-7.1-M2 and M2 antibody specificity.1: blank control; 2: negative control(p3xFLAG-CMV-7.1); 3: FLAG-M1 protein; 4: FLAG-M2 protein.

Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)染p3xFLAG-CMV-7.1-M2真核表達(dá)質(zhì)粒24 h后，間接免疫熒光檢測M2蛋白亞細(xì)胞定位。同時(shí)使用豬流感病毒感染24 h的Vero細(xì)胞為對(duì)照，比較分析了M2蛋白的亞細(xì)胞定位。如圖5所示，真核表達(dá)的 M2蛋白主要定位于細(xì)胞漿中，病毒感染細(xì)胞中的 M2蛋白也主要在胞漿中表達(dá)，與真核轉(zhuǎn)染的M2蛋白表達(dá)一致。

3 討論

圖4 病毒感染Vero細(xì)胞中不同蛋白時(shí)空表達(dá)情況以及M2抗體特異性Fig.4 Western blotting analysis the kinetics of viral protein expression of Vero cell infected with SIV and M2 antibody specificity.Mock is negative control, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24 h were various times post-infection, expression analysis of SIV M2,NS1, NP, M1, β-actin were used as a protein loading control.

圖5 免疫熒光對(duì)大鼠抗M2抗體特異性檢測和流感病毒M2蛋白亞細(xì)胞定位Fig.5 Specificity analysis of M2 antibody and subcellular localization of SIV M2 protein.FLAG-M2were stained with mouse anti-FLAG antibody(red).M2 protein of SIV infection were stained with rat anti-M2 antibody(green).The nucleus were stained with DAPI(blue).Merge is combined with two images.

本研究克隆了豬流感(A/Swine/jiangsu/2/2006(H3N2))M2基因的全長編碼區(qū)，序列長度為294 bp，與 NCBI上的序列比對(duì)分析表明，其與H9N2亞型序列同源性高達(dá) 100%(A/swine/Shandong/nc/2005(H9N2))和 97%(A/chicken/Jiangsu/wa/2002(H9N2))。這是由于流感病毒的遺傳重組特性決定，進(jìn)化分析表明[11]，該毒株與H9N2親緣關(guān)系較近，并且該病毒的M2和H9N2比較發(fā)現(xiàn)僅在83位和88位氨基酸由A變成V，這些突變沒有改變氨基酸的性質(zhì)，推測該病毒在重配過程中M基因可能來源于H9N2毒株。

M2蛋白在流感病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用，本研究構(gòu)建豬H3N2亞型流感病毒的M2重組原核表達(dá)和真核表達(dá)質(zhì)粒，建立了兩種表達(dá)系統(tǒng)。利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備較純的抗原，該方法制備的抗原具有便宜方便的特點(diǎn)。有研究表明 M2蛋白膜外區(qū)具有高度保守性，可以作為疫苗選擇的對(duì)象[12]。所以原核表達(dá)系統(tǒng)可以作為豬流感疫苗生產(chǎn)的一條途徑。本研究建立的真核表達(dá)系統(tǒng)，既能研究M2蛋白的亞細(xì)胞定位，也能為研究該蛋白的功能打下基礎(chǔ)。

本研究以原核表達(dá)產(chǎn)物免疫Wistar大鼠制備抗M2抗體，具有較高的效價(jià)。特異性研究表明，該抗體既能識(shí)別真核表達(dá)的 M2蛋白，同時(shí)也能識(shí)別病毒天然表達(dá)的蛋白，為研究 M2蛋白在病毒復(fù)制、病毒與細(xì)胞相互作用中所扮演的角色提供了較好的工具。在病毒感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)取樣，Western blotting檢測分析表明，M2蛋白在病毒感染大約12 h后表達(dá)量開始急劇上升，與病毒在此時(shí)間點(diǎn)復(fù)制速度增加密切相關(guān)[13]，NS1蛋白最早出現(xiàn)，標(biāo)志著復(fù)制的開始，由于 M2蛋白出現(xiàn)時(shí)間稍微晚于其他早期蛋白，因此該蛋白可以作為病毒復(fù)制晚期的標(biāo)志。間接免疫熒光結(jié)果表明，不管是在真核轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，還是在病毒感染細(xì)胞中，M2蛋白的亞細(xì)胞定位都是在胞漿中，這與其離子通道蛋白的功能密切相關(guān)[14]。

2009年3月以來，爆發(fā)在墨西哥的豬流感，引起100多人死亡，并迅速傳播到全世界很多國家，給人類帶來巨大的災(zāi)難。本研究中的M2蛋白與新的甲型 H1N1氨基酸序列分析表明，它們之間存在 13、14、16、28、31、43、77、84、88位氨基酸差異，主要分布于M2蛋白的膜外區(qū)和膜內(nèi)區(qū)，跨膜區(qū)高度保守，新型流感病毒毒力變化是否與此有關(guān)需要進(jìn)一步研究。為了預(yù)防和控制流感的大爆發(fā)，研究控制流感病的疫苗和藥物已迫在眉睫，本研究為以 M2為靶標(biāo)的抗流感藥物研究提供了基礎(chǔ)材料。

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Characterization of M2 gene of H3N2 subtype swine influenza virus

Xiaodu Wang, Peijun Chen, Yang Shen, Yafeng Qiu, Xufang Deng, Zixue Shi, Lina Peng,Jinyan Luo, Chao Liu, and Zhiyong Ma
Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Shanghai 200241, China

Received:September 4, 2009;Accepted:November 11, 2009

Supported by:Shanghai Pujiang Program(No.07pj14109), Key Project of Basic Research for National Non-profit Fund of China(No.2007JB0264).

Corresponding author:Zhiyong Ma.Tel: +86-21-34293139; E-mail: zhiyongma@shvri.ac.cn上海市浦江人才計(jì)劃(No.07pj14109)，中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2007JB0264)資助。