響應(yīng)面法優(yōu)化耐高溫酵母生產(chǎn)高濃度乙醇

申乃坤，王青艷，陸雁，秦燕，黃日波

廣西科學(xué)院國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，南寧 530007

響應(yīng)面法優(yōu)化耐高溫酵母生產(chǎn)高濃度乙醇

申乃坤，王青艷，陸雁，秦燕，黃日波

廣西科學(xué)院國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，南寧 530007

利用耐高溫酵母GXASY-10菌株對(duì)木薯粉同步糖化(SSF)法生產(chǎn)高濃度乙醇的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，首先應(yīng)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響酒精高溫高濃度發(fā)酵的重要參數(shù)，采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大酒精生產(chǎn)區(qū)域后，利用 Box-Behnken設(shè)計(jì)確定重要參數(shù)的最佳水平。篩選結(jié)果表明，影響酒精產(chǎn)量的重要參數(shù)是液化時(shí)間、糖化酶用量和初始木薯粉(底物)濃度。最佳工藝條件為：液化時(shí)間為35 min，糖化酶添加量為1.21 AGU/g底物，底物濃度為37.62%。20 L發(fā)酵罐在此條件下(發(fā)酵溫度37℃，轉(zhuǎn)速100 r/min)經(jīng)過48 h發(fā)酵，酒精濃度可達(dá)16.07%(V/W)。優(yōu)化條件與初始條件相比較，酒精濃度提高了33%。

燃料乙醇，木薯，同步糖化發(fā)酵，Plackett-Burman設(shè)計(jì)，Box-Behnken設(shè)計(jì)

Abstract:We optimized the conditions of simultaneous saccharification and fermentation(SSF)from cassava flour into high-concentration ethanol by thermophilic yeast GXASY-10.Based on the single factor experiment, we screened the important parameters by Plackeet-burman design.We used the path of steepest ascent to approach to the biggest region of ethanol production subsequently.Then, we obtained the optimum values of the parameters by Box-Behnken design.The results showed that the important parameters were the liquefaction time, glucosidase dosages and initial concentration of cassava flour(substrate).The optimum technical conditions were as follows: liquefaction time 35 min, glucosidase dosages 1.21 AGU/g substrate and initial substrate concentration 37.62%.Under such optimum conditions, the ethanol yield of 20 L fermentor reached 16.07%(V/W)after 48 h fermentation at 37oC and 100 r/min.The ethanol content increased 33% than that under the original condition.

Keywords:fuel ethanol, cassava, simultaneous saccharification and fermentation(SSF), Plackett-Burman design,Box-Behnken design

隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，能源短缺成為各國面臨的重大課題。實(shí)施燃料乙醇計(jì)劃，對(duì)于發(fā)展國民經(jīng)濟(jì)、保障能源安全和改善環(huán)境等具有十分重要的意義[1]。目前在燃料乙醇的發(fā)展上我國政府提出“因地制宜，非糧為主”的原則。木薯(Cassava)是一種極具潛力的非糧能源作物，木薯干片淀粉含量可達(dá) 70%以上，被稱為“淀粉之王”[2]。以木薯為原料生產(chǎn)燃料乙醇，不僅能夠滿足原料長期穩(wěn)定經(jīng)濟(jì)的供應(yīng)，而且不影響我國的糧食安全，同時(shí)可減少環(huán)境污染，提高農(nóng)民收入。

在我國南方地區(qū)及盛夏的北方，氣溫常達(dá)到35℃以上，而一般釀酒酵母最適發(fā)酵溫度在30℃左右，這勢(shì)必增加生產(chǎn)中的冷卻成本。因此，選育合適的耐高溫酵母菌種，采用高溫發(fā)酵可大大降低酒精生產(chǎn)的成本[3]。所謂“高濃度發(fā)酵”是指糖化醪中含有30%或更高的可溶性固形物進(jìn)行的發(fā)酵。與傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵工藝相比，高濃度酒精發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)是：發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)物乙醇濃度高，不僅節(jié)省后續(xù)精餾操作的能耗，而且減少廢糟液量，廢糟液處理的能耗也降低；同時(shí)VHG發(fā)酵從液化、糖化到發(fā)酵的物料流量都減少，因此這些環(huán)節(jié)的加熱與冷卻負(fù)荷都相應(yīng)降低，節(jié)省了操作能耗和設(shè)備投資。因此，多年來一直是各國研究者研究的重點(diǎn)領(lǐng)域[4]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于高濃度乙醇發(fā)酵的報(bào)道多集中于葡萄糖培養(yǎng)基及玉米、小麥等糧食原料。Rasmus等[5]以小麥粉為原料采用同步糖化發(fā)酵工藝，32℃條件下經(jīng)過 70 h發(fā)酵，酒精濃度可達(dá) 12.60%(W/W)。Thomas等[6]以小麥粉為原料在不添加其他營養(yǎng)條件下僅通過增大接種量，20℃條件下經(jīng)過170 h發(fā)酵，酒精濃度可達(dá)21%(V/V)，同時(shí)還證明死亡的酵母菌細(xì)胞可以為發(fā)酵提供營養(yǎng)成分。Thomas等[7]發(fā)現(xiàn)，在高濃度發(fā)酵條件下，加入滲透壓保護(hù)劑，有助于增加酒精產(chǎn)量，提高糖利用率。張書祥等[8]以瓜干為原料，通過添加氮源及其復(fù)合物能改善酵母生長環(huán)境，縮短發(fā)酵周期，提高酒精產(chǎn)量。黃宇彤等[9]研究發(fā)現(xiàn)添加 Tween80和麥角甾醇的高濃度酒精發(fā)酵，最終酒精濃度可以達(dá)到15.32%(V/V)。以上研究重在提高酒精濃度，很少兼顧到高溫高濃度發(fā)酵。而對(duì)高溫發(fā)酵的研究主要集中在耐溫酵母的篩選和改造方面。

本研究針對(duì)高濃度乙醇發(fā)酵過程中發(fā)酵底物抑制發(fā)酵的缺點(diǎn)，以木薯粉為原料在高溫發(fā)酵條件下(37℃)采用同步糖化發(fā)酵(SSF)模式進(jìn)行發(fā)酵，在省略糖化工段的同時(shí)，可部分地解決底物抑制問題。在前期單因素研究的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)影響乙醇發(fā)酵的條件及培養(yǎng)基主要因子進(jìn)行了優(yōu)化和篩選，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，篩選出對(duì)目標(biāo)值影響最大的關(guān)鍵因素；進(jìn)一步通過響應(yīng)面理論(RSM)對(duì)木薯酒精發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及原料

耐溫菌種：釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae GXASY-10為本實(shí)驗(yàn)室突變選育后得到的耐高溫高產(chǎn)菌株。

木薯粉：淀粉含量70%左右，廣西明陽淀粉化工股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 所用酶類

耐高溫淀粉酶：Liquozyme Supra，購自諾維信公司，標(biāo)準(zhǔn)酶活為90 KNU/g。

糖化酶：Dextrozyme DX，購自諾維信公司，標(biāo)準(zhǔn)酶活500 AGU/mL。

纖維素酶：寧夏和氏璧有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 發(fā)酵醪液的制備

木薯與自來水以設(shè)定料水比混合，加入液化酶，迅速加熱到90℃～95℃，液化30～60 min，冷卻調(diào)pH，降溫到37℃，加入適量糖化酶，接種發(fā)酵。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定方法

還原糖的測(cè)定：3，5-二硝基水楊酸比色法[10]。乙醇濃度的測(cè)定：氣相色譜法[11]。

1.2.2 數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法

Plackeet-Burman[12]設(shè)計(jì)是一種有效的兩水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的因素。酒精發(fā)酵工藝中涉及的參數(shù)較多，Plackett-Burman適合于本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)：響應(yīng)面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)結(jié)果，故只有在最先逼近最大目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)的結(jié)果，來確定是否進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

響應(yīng)面(RSM)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用Box-Behnken[13]法，對(duì)Plackeet-Burman設(shè)計(jì)篩選出的關(guān)鍵因子和最陡爬坡設(shè)計(jì)確定的濃度進(jìn)一步研究，以獲得最優(yōu)培養(yǎng)基。響應(yīng)面法是通過近似構(gòu)造一個(gè)具有明確表達(dá)形式的多項(xiàng)式來表達(dá)隱式功能函數(shù)。在響應(yīng)曲面的最優(yōu)點(diǎn)附近，曲面效應(yīng)是主導(dǎo)項(xiàng)，用二階模型來逼近響應(yīng)曲面：

式中：y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值，即酒精濃度；b0為回歸系數(shù)；bi表示xi的線性效應(yīng)；bii表示xi的二次效益；bij表示xi與xj間的線性交互效益。用Design-espert7.1軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，并對(duì)擬合方程作顯著性檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重要因素的篩選

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和有關(guān)高濃度發(fā)酵的參考文獻(xiàn)，試驗(yàn)選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N-12的設(shè)計(jì)，對(duì)9個(gè)因素進(jìn)行考察，并余留2個(gè)空白項(xiàng)以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。每個(gè)因素取 2個(gè)水平，以發(fā)酵醪液酒精體積濃度(%，V/W)的平均值為響應(yīng)值Y，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置平行3個(gè)。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣見表 2，對(duì)表 2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3。“Prob＞F”小于0.05，表明因素是重要的?！癕odel Prob＞F”等于0.0093，表明模型是重要的。通過表4的分析，本實(shí)驗(yàn)選擇了“Prob＞F”小于0.05的3個(gè)因素X2、X3、X8，即液化時(shí)間、糖化酶用量和底物濃度影響酒精發(fā)酵的重要因素。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示，最大酒精濃度區(qū)在第3次附近，故以實(shí)驗(yàn)3的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。

2.3 應(yīng)用響應(yīng)面分析法確定重要因素的最佳水平

2.3.1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

運(yùn)用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得到的中心點(diǎn)對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定的3個(gè)顯著性影響因子各取3個(gè)水平。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)安排響應(yīng)面試驗(yàn)各個(gè)因素水平如表6所示。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面分析試驗(yàn)軟件設(shè)計(jì)了3因素3水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表7。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為兩類：一類是析因點(diǎn)，共12個(gè)；一類是零點(diǎn)(試驗(yàn)點(diǎn)1，4，8)為區(qū)域的中心點(diǎn)。零點(diǎn)重復(fù)3次，用于估計(jì)試驗(yàn)的誤差。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)和水平Table 1 Factors levels of PIackett-Burman design

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)表和結(jié)果Table 2 Experimental design of Plackett-Burman and corresponding results

表3 方差分析Table 3 Univariate analysis of variance

表4 參數(shù)估計(jì)和各因素影響Table 4 Parameter estimation and effects of different factors

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

表6 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)參數(shù)水平Table 6 Factors and levers of response surface central composite design

根據(jù)表7的試驗(yàn)結(jié)果，以酒精產(chǎn)率 Y值為響應(yīng)值，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可得到如下方程：

決定系數(shù)R2=0.9687，說明方程的擬合度很好，可以用該回歸方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)結(jié)果進(jìn)行分析。回歸方程的方差分析還表明，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響是十分顯著的，交互項(xiàng)的影響不明顯，試驗(yàn)因子與響應(yīng)值之間不是線性關(guān)系。

對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。

表 8的方差分析結(jié)果表明，“Model Prob＞F”等于 0.003遠(yuǎn)小于 0.05，說明模型是重要的。一般認(rèn)為，相關(guān)系數(shù) R2大于 0.9，表明預(yù)測(cè)值能與試驗(yàn)值具有高度相關(guān)度[14]。在這個(gè)試驗(yàn)中，R2=0.9687，表明僅有不到4%的酒精產(chǎn)量變異不能由該模型解釋。

圖形能夠提供一種形象的觀測(cè)響應(yīng)值和試驗(yàn)參數(shù)水平關(guān)系的方法。通過上面多元回歸方程做響應(yīng)曲面及其等高線圖，結(jié)果見圖1～3。

由響應(yīng)面的規(guī)范分析可知，回歸模型存在最大穩(wěn)定點(diǎn)。Y的最大估計(jì)值為16.05，最佳點(diǎn)為X1=1.00、X2=0.12、X3=0.81，即液化時(shí)間為35 min, 糖化酶添加量為1.21 AGU/g底物，底物濃度為37.62%，此點(diǎn)醪液的酒精濃度為 16.05%。對(duì)最佳點(diǎn)進(jìn)行 5次20 L發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵過程中殘?zhí)呛途凭珴舛鹊淖兓钠骄狄妶D4。發(fā)酵結(jié)果平均值為16.07%，表明預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證試驗(yàn)很接近，說明回歸方程能夠比較真實(shí)地反映各篩選因素對(duì)酒精發(fā)酵的影響。

表7 Box-Bohnkon試驗(yàn)設(shè)計(jì)表和結(jié)果Table 7 Experimental design of Box-Bohnkon and corresponding results

表8 Box-Bohnkon試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 8 Analysis of variance of Box-Bohnkon experiment

圖1 液化時(shí)間和糖化酶用量對(duì)酒精產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Surface layer of the mutual-affection of liquefaction time and glucoamylase dosage on ethanol yield.

圖2 液化時(shí)間和底物濃度對(duì)酒精產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Surface layer of the mutual-affection of liquefaction time and substrate concentration on ethanol yield.

圖3 糖化酶用量和底物濃度對(duì)酒精產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Surface layer of the mutual-affection of glucoamylase dosage and substrate concentration on ethanol yield.

圖4 20 L 發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)酵結(jié)果Fig.4 Demonstration test results of 20 L fermentor.

3 結(jié)論

應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)尿素、硫酸鎂、海藻糖、糖化酶、纖維素酶、磷酸二氫鉀添加量以及液化時(shí)間、底物濃度和pH值9個(gè)因素進(jìn)行了兩水平12次試驗(yàn)，并從中篩選出液化時(shí)間、糖化酶添加量和底物初始濃度為主要影響因素；通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定中心點(diǎn)，進(jìn)一步用響應(yīng)面分析法對(duì)主要因素進(jìn)行3因素3水平的15次試驗(yàn)，確定主要因素的最佳量。得到最優(yōu)點(diǎn)醪液酒精濃度為16.05%。利用得到的最優(yōu)條件進(jìn)行5次20 L發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)，酒精的平均濃度為16.07%(V/W)，較初始條件(指未進(jìn)行優(yōu)化前Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)采用的較低水平的條件，此時(shí)酒精濃度為12%)提高33%以上。表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝是提高酒精發(fā)酵濃度的有效途徑之一。該菌株在高溫(37℃)發(fā)酵條件下仍有很高的產(chǎn)酒精能力，是一株很有應(yīng)用開發(fā)潛力的耐高溫酒精發(fā)酵菌種。

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Enhancing ethanol production using thermophilic yeast by response surface methodology

Naikun Shen, Qingyan Wang, Yan Lu, Yan Qin, and Ribo Huang
National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery, Guangxi Academy of Sciences, Nanning 530007, China

Received:September 15, 2009;Accepted:November 16, 2009

Supported by:National Science and Technology Ministry(No.BAD75B05), International Scientific and Technological Cooperation(No.2008DFA30710),Science and Research Foundation of Guangxi Academy(No.0701).

Corresponding author:Ribo Huang.E-mail: rbhuang@gxas.cn國家科技支撐計(jì)劃(No.BAD75B05)，國際科技合作項(xiàng)目(No.2008DFA30710)，桂科院研(No.0701)資助。