納米羥基磷灰石的精氨酸表面修飾及其與基因的結(jié)合性能

趙顏忠，朱曬紅，譚 娟，黃艷艷，李志友，周科朝

(1. 中南大學(xué) 粉末冶金國家重點實驗室，長沙 410083；2. 中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院，長沙 410013；3. 中南大學(xué) 醫(yī)用材料與器械研究中心，長沙 410013)

納米羥基磷灰石的精氨酸表面修飾及其與基因的結(jié)合性能

趙顏忠1,2,3，朱曬紅2,3，譚 娟2，黃艷艷2，李志友1，周科朝1,3

(1. 中南大學(xué) 粉末冶金國家重點實驗室，長沙 410083；2. 中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院，長沙 410013；3. 中南大學(xué) 醫(yī)用材料與器械研究中心，長沙 410013)

采用水熱合成法制備經(jīng)精氨酸表面修飾的羥基磷灰石納米顆粒(Arg-nHAP)。利用透射電鏡(TEM)、Zeta電位分析儀、傅立葉紅外光譜儀和X射線衍射(XRD)對Arg-nHAP的形貌、結(jié)構(gòu)、晶粒粒徑和Zeta電位進行表征，并將其與質(zhì)粒DNA(pEGFP-N1)進行凝膠電泳實驗，研究Arg-nHAP對基因的結(jié)合和保護性能。結(jié)果表明：制備的Arg-nHAP粒徑較均勻，約為50 nm～80 nm，分散性良好；在pH=7.4時，納米顆粒的表面凈電荷均值為30.89 mV，可與帶負電荷的質(zhì)粒DNA通過靜電結(jié)合快速形成納米顆粒?質(zhì)粒DNA復(fù)合物，對結(jié)合的DNA起到明顯的保護作用；經(jīng)精氨酸表面修飾的Arg-nHAP可成為一種有效的基因結(jié)合載體。

羥基磷灰石；精氨酸；水熱合成；基因載體

Abstract:An arginine modifying nano-hydroxyapatite (nHAP) was synthesized by hydrothermal synthesis. The morphology, structure, crystallite size and Zeta potential of the Arg-nHAP were characterized by X-ray diffractometry(XRD), transmission electron microscopy(TEM), Fourier transform infrared (FTIR) and Zeta potential analyzer. The binding and protecting properties of Arg-nHAP to DNA were tested by electrophoresis experiment. The results show that the Arg-nHAP is very fine and well distributes, the mean diameter of the nanoparticles is 50?80 nm and its Zeta potential is about 30.89 mV at pH of 7.4. Arg-nHAP/DNA nanocomplexes can be formed rapidly by electrostatic interaction of nanoparticles with DNA having negative electrons. The nHAP modified with arginine can effectively bind and protect DNA and may be used as a potential gene carrier.

Key words:hydroxyapatite; arginine; hydrothermal synthesis; gene carrier

目前，基因治療仍未能取得實質(zhì)性突破，主要是因為缺乏高效安全的基因載體。因為病毒載體存在安全性問題，美國FDA已停止了病毒載體的臨床應(yīng)用審批[1]。發(fā)展安全、無/低毒、無免疫原性及易于組裝的新型基因載體材料已成為國際醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點。非病毒載體系統(tǒng)雖然無病毒毒性和免疫原性等，但傳遞效率不如病毒載體系統(tǒng)。脂質(zhì)體和陽離子多聚物等有機物是目前基因治療研究普遍采用的非病毒載體材料，但脂質(zhì)體體內(nèi)轉(zhuǎn)染的不穩(wěn)定性和陽離子多聚物(如聚乙烯亞胺和殼聚糖)存在細胞毒性或轉(zhuǎn)染率較低等問題,阻礙了其臨床應(yīng)用[2?3]。納米生物技術(shù)的發(fā)展為基因傳遞系統(tǒng)提供了新的材料和方法,目前研究較多的納米載體主要有硅氧化物[4]和鐵氧化物[5]等，但也存在轉(zhuǎn)染率較低和細胞毒性，以及體內(nèi)不易排解等問題[6]。納米羥基磷灰石(Nanohydroxyapatite，nHAP)與人體硬組織的無機成分相似，具有天然的生物相容性，與普通的羥基磷灰石材料相比，具有更佳的理化性質(zhì)和生物學(xué)性能，如溶解度較高、表面能較大和生物活性更強[7-8]。尤其重要的是，納米羥基磷灰石顆粒本身具有抑制癌細胞生長的作用[9]。羥基磷灰石還是一種高效的吸附材料，能夠結(jié)合核酸和蛋白質(zhì)[10?11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]，納米羥基磷灰石顆粒(nHAP)可作為基因載體，轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白報告基因的轉(zhuǎn)染率可達到同等條件下脂質(zhì)體的50%。FRAYSSINET等[13]應(yīng)用納米羥基磷灰石顆粒和DNA共沉淀成功轉(zhuǎn)染LacZ報告基因入胞，進一步證明了納米羥基磷灰石的基因轉(zhuǎn)染能力。TAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)魚精蛋白修飾后，納米羥基磷灰石基因轉(zhuǎn)染率可進一步提高。孫虹等[15]用納米羥基磷灰石顆粒轉(zhuǎn)染 NT-3基因，發(fā)現(xiàn)不僅可轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的小鼠耳蝸神經(jīng)元，而且能夠轉(zhuǎn)染到活體豚鼠的耳蝸神經(jīng)元內(nèi)，這證明了納米羥基磷灰石載體在體外和體內(nèi)均具有結(jié)合、保護和釋放基因的能力。上述研究表明，納米羥基磷灰石顆?？赡苁且环N高效安全的基因載體材料。但是，需要進一步提高這種載體材料的基因轉(zhuǎn)染率。

本實驗選取精氨酸(Arginine)作為納米羥基磷灰石顆粒修飾物，一方面，由于親水性的精氨酸帶有胍基基團?(CH2)3NHC(NH2)+，等電點為 10.76，在實驗條件下，反應(yīng)液pH值將一直小于精氨酸的等電點，因而在整個反應(yīng)過程中精氨酸帶正電荷。另一方面，由于精氨酸和胍基官能團被發(fā)現(xiàn)能有效穿透細胞膜[16]，可在DNA轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)的過程發(fā)揮著非常重要的作用，暗示富精氨酸短肽能有效地提高基因轉(zhuǎn)染效率, 但富精氨酸短肽介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的機理依然不大清楚, 明顯有別于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機制[17]。本文作者旨在探討精氨酸修飾的水熱合成顆粒(Arg-nHAP)的形貌與表面結(jié)構(gòu)，及其與基因的結(jié)合能力。

1 實驗

1.1 實驗材料

本研究采用的實驗材料主要如下：硝酸鈣Ca(NO3)2·4H2O(AR，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)，磷酸銨(NH4)3PO4·3H2O(AR，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)，精氨酸(Arginine，Sigma公司)，脫氧核糖核酸酶Ⅰ(Invitrogen公司)，pEGFP-N1質(zhì)粒(武漢市晶賽生物工程技術(shù)有限公司)，以及自行配制的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和HEPES緩沖鹽溶液(HBS)。

1.2 Arg-nHAP粉體的水熱合成

分別制取硝酸鈣 Ca(NO3)2·4H2O、磷酸氫二氨(NH4)2HPO4)的水溶液。精氨酸預(yù)先加入到磷酸鹽溶液中，充分攪拌后滴加硝酸鈣溶液，Ca與P的摩爾比為1.67。反應(yīng)溫度為 60 ℃，采用氨水或尿素調(diào)節(jié)溶液pH值。待鈣、磷溶液攪拌混勻后，再將溶液轉(zhuǎn)入到水熱釜中，在設(shè)定的水熱溫度下持續(xù)反應(yīng)。待水熱溶液反應(yīng)完全，取其中的沉淀經(jīng)去離子水和無水乙醇洗滌、過濾，真空干燥，獲得羥基磷灰石粉末。

1.3 Arg-nHAP顆粒的表征

采用掃描電鏡(SEM，JSM?6360LV, JEOL Japan)分析Arg-nHAP納米粒晶體形貌和粉體粒度，采用X射線衍射(XRD)對 Arg-nHAP進行物相分析(Rigaku D-Max/2550VB+, Tokyo, Japan，Cu Kα輻射，λ=1.54178?，40 kV，30 mA)，掃描角度和速度采用25?～55?，2.4(?)/min或5?～75?，5(?)/min，傅立葉紅外光譜儀為Nicolet Nexus?470，KBr制片。

1.4 Arg-nHAP混懸液的制備

取精氨酸修飾后的Arg-nHAP粉末0.5 g, 放入離心管, 加去離子水20 mL，濃度為25 g/L, 用超聲波分散60 min (Ultrasonic Hemogenizer 24710，USA ) , 靜置觀察2 h，羥基磷灰石納米顆?；鞈乙簾o分層, 呈乳狀。將納米顆?；鞈乙褐萌?0 mL 玻璃瓶, 高壓滅菌后備用。取1 mL 納米顆?；鞈乙簶颖荆曁幚? min后，用透射電鏡(TEM，Tecnai G2 20ST,FEI Co.)觀察納米混懸液顆粒粒度和分散狀態(tài)。

1.5 Arg-nHAP的Zeta電位測定

pH=7.4時，采用英國 Malvern Instrument公司Zetasizer3000 HS納米粒度及電位分析儀測定 nHAP及經(jīng)精氨酸修飾的 Arg-nHAP的電泳遷移率(Electrophoretic mobility，EPM)，從而計算出Zeta電位。nHAP及精氨酸修飾的Arg-nHAP各8例，每例樣本測試重復(fù)3次，取平均值。

1.6 Arg-nHAP與質(zhì)粒DNA的結(jié)合實驗

在不同pH值下，將Arg-nHAP與pEGFP-N1質(zhì)粒DNA按質(zhì)量比 30:1混合，同時在 pH=7.4時，將Arg-nHAP與pEGFP-N1質(zhì)粒分別按Arg-nHAP與DNA質(zhì)量比0:1、10:1、30:1、50:1、70:l和90:1在離心管內(nèi)混合，其中DNA的濃度恒定為0.1 g/L，室溫靜置20 min，輕搖混勻后于4 ℃時靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，離心后取上清液10 μL，0.7%瓊脂糖凝膠電泳(80 V)45 min，EB染色10 min，采用凝膠成像系統(tǒng)觀測。

1.7 Arg-nHAP的DNA抗核酸酶保護實驗

Arg-nHAP與DNA按照上述最佳條件結(jié)合形成復(fù)合體后，將其放入5%小牛血清和5%胎牛血清(血清中存在大量可降解DNA的成分)中重懸，于37 ℃培育8 h；或者將Arg-nHAP-DNA復(fù)合體與每微克DNA中含1 mU的DNaseⅠ混合，在37 ℃培育1 h。同時也將寡質(zhì)粒DNA作對照。以速度為10 000 r/min離心10 min，離心后取沉淀用洗脫液(20 mmol/L Tris.Cl，pH 7.4，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl；50 %的乙醇，室溫保存)洗脫，離心后取上清液，瓊脂糖凝膠電泳檢測；對照寡質(zhì)粒DNA組直接用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 Arg-nHAP顆粒的形貌

圖1所示為水熱合成HAP顆粒的TEM像。由圖1可看出，未經(jīng)修飾的顆粒樣品呈短柱狀，同一顆粒的橫截面尺寸均勻，約為50～100 nm。在長度方向上，顆粒間尺寸差異較大，約為50～200 nm。加入精氨酸后，顆粒尺寸減小，各方向的尺寸差異變小，呈粒狀，粒徑約為50～80 nm。在水熱條件下合成HAP的過程中，由于精氨酸在結(jié)晶析出HAP晶粒表面的吸附存在晶面的選擇性，影響了HAP晶粒長大的行為。熱力學(xué)平衡條件下 HAP晶體的擇優(yōu)生長方向為[001]。在水熱介質(zhì)中精氨酸帶正電性的胍基基團?(CH2)3NHC(NH2)+可與 HAP(001)面裸露的負電性羥基(—OH)發(fā)生靜電作用，導(dǎo)致精氨酸更傾向于吸附在HAP的(001)面，因此，精氨酸的吸附更大程度地阻礙了溶液合成產(chǎn)物在HAP(001)面的析出，使得HAP各晶體方向的生長速度差異減小，晶體各方向的尺寸差異同時降低。另一方面，由于各個晶面不同程度地吸附一定數(shù)量的精氨酸，HAP晶體生長受阻，要求更多的新顆粒形核析出，以降低溶液的過飽和度。高形核密度有利于獲得更細小的HAP顆粒。

2.2 Arg-nHAP顆粒的表征

圖1 水熱合成HAP顆粒的TEM像Fig.1 TEM images of HAP crystal synthesized by hydrothermal method: (a) Without amino acid; (b) With arginine

圖2 160 ℃時水熱法合成nHAP的XRD譜Fig.2 XRD patterns of nHAP particles synthesized by hydrothermal method at 160 ℃: (a) Without extraneous additives; (b) With arginine

圖2所示為兩組樣品的XRD譜。從圖2可以看出：所制備的nHAP樣品的XRD譜相差不大，特征峰尖銳明顯，表明所制備的樣品的結(jié)晶程度比較高，晶形完整。但主要特征峰相對強度存在細微差異，相對于(002)峰，Arg-nHAP樣品的(300)峰的強度增大；Arg-nHAP樣品的(002)峰與(211)峰的比值降低，主要特征峰的相對強度與HAP標準粉末卡片JCPDs 9?432的對應(yīng)性提高。這證實圖1所顯示的Arg-nHAP樣品各方向尺寸傾向于一致、粉末顆粒粒狀特征加強的實驗現(xiàn)象。

圖3所示為水熱合成的nHAP傅立葉紅外光譜。由圖3可看出，兩組樣品的紅外光譜的波形相似，譜中主要峰的位置相同。較強的峰線出現(xiàn)在 565.25、604.21、1 035.78、3 441.75 cm?1等位置，并在1 106.57、1 420.30、1 631.24和3 570.12 cm?1等位置出現(xiàn)強度較弱或位置較寬的峰線。理論上 PO43?的 4種振動方式對應(yīng)峰的位置分別如下：ν1峰在960 cm?1附近，ν2峰位于470至440 cm?1區(qū)域，ν3位于1 190至976 cm?1區(qū)域，ν4峰位于600至560 cm?1區(qū)域。因此，565.25、604.21和1 035.78 cm?1的強峰以及1 106.57 cm?1的弱峰是nHAP中PO43?根產(chǎn)生的。晶格中的水分子特征峰出現(xiàn)在 3 550～3 200 cm?1區(qū)域，因此，3 441.75和3 570.12 cm?1位置的峰是晶格水和磷灰石羥基(OH?)的反映。1 631.24 cm?1處特征峰是H2O的振動峰，表明粉末樣品表面吸附少量的水分。氨基(-NH2)的特征峰出現(xiàn)在 1 400～1 420 cm?1區(qū)間，1 420.30 cm?1峰可能是少量來自于原料磷酸氫二氨的銨根(NH4+)、氨基酸的殘留物吸附在HAP的反映。對于加入精氨酸的樣品，該峰強度有所增強(見圖(b))，說明存在氨基酸殘留物。

圖3 水熱合成HAP的傅立葉紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of nHAP prepared by hydrothermal synthesis: (a) Without amino acid; (b) With arginine

2.3 Arg-nHAP顆粒的Zeta電位

圖4所示為pH值為7.4時Arg-nHAP的Zeta電位圖。由圖4可看出，在弱堿性的條件下(pH=7.4)，Arg-nHAP的Zeta電位為(30.9±8.2) mV，而未修飾的nHAP的Zeta電位為(?12.5±6.5) mV。這說明合成過程中精氨酸的加入使得nHAP顆粒表面的帶電狀態(tài)發(fā)生根本性的轉(zhuǎn)變，由常規(guī)nHAP的負Zeta電位值變?yōu)锳rg-nHAP的正值。這一變化是因為Arg-nHAP顆粒表面吸附了氨基酸或氨基酸殘留物。在隨后的研究中，將設(shè)法從 Arg-nHAP合成的水溶液介質(zhì)中提取該物質(zhì)，并進行標定，進而探討精氨酸影響HAP的水熱結(jié)晶行為和表面帶電狀態(tài)的深層次機理。

圖4 pH值為7.4時Arg-nHAP的Zeta電位曲線Fig.4 Zeta potential curve of Arg-nHAP at pH of 7.4

2.4 Arg-nHAP與質(zhì)粒DNA的結(jié)合性能

圖5 Arg-nHAP/DNA復(fù)合物的凝膠電泳照片F(xiàn)ig.5 Electrophoresis photos of Arg-nHAP/DNA composite(M: Marker; 1: Positive control; 2: Mass ratio of Arg-nHAP to DNA 10:1; 3: Mass ratio of Arg-nHAP to DNA 30:1; 4: Mass ratio of Arg-nHAP to DNA 50:1; 5: Mass ratio of Arg-nHAP to DNA 70:1; 6: Negative control

圖5所示為Arg-nHAP與DNA(pEGFP-N1質(zhì)粒)的復(fù)合物瓊脂糖凝膠電泳圖。檢測發(fā)現(xiàn)，當Arg-nHAP與pEGFP-N1質(zhì)粒質(zhì)量比分別為30:1、50:1和70:1時，其反應(yīng)上清液在瓊脂糖膠電泳圖中未發(fā)現(xiàn)DNA條帶，表明所有的DNA已完全與Arg-nHAP結(jié)合，且30 μg Arg-nHAP至少結(jié)合1 μg DNA。采用紫外分光光度計測定的260 nm吸光值也證明了同樣的結(jié)果。

DNA與Arg-nHAP結(jié)合后形成Arg-nHAP/DNA復(fù)合物，其密度比DNA的大。因此，可通過比較離心前后液體中的 DNA濃度來判斷 DNA是否與Arg-nHAP有效結(jié)合。本研究中的DNA結(jié)合實驗顯示，Arg-nHAP與DNA質(zhì)量比為10:1時僅結(jié)合極少量的DNA，質(zhì)量比大于30:1的體系中Arg-nHAP幾乎結(jié)合了全部的DNA。

2.5 Arg-nHAP對DNA抗核酸酶的保護性能

血清中存在可降解DNA的成分，將寡質(zhì)粒DNA與血清在37 ℃時溫育8 h后，發(fā)現(xiàn)DNA已被完全降解；而DNA在與Arg-nHAP結(jié)合后形成了復(fù)合體，與5%胎牛血清在37 ℃時溫育8 h后，產(chǎn)物瓊脂糖膠電泳結(jié)果顯示DNA條帶大小正常，沒有脫尾現(xiàn)象(見圖 6)。DNase Ⅰ消化實驗也證明這一結(jié)果。表明Arg-nHAP與DNA結(jié)合后，能有效保護DNA，使之不被血清中核酸酶降解。

隨Arg-nHAP與DNA質(zhì)量比的增大，載體保護DNA抗核酸酶的能力相應(yīng)增加，質(zhì)量比為30:1時，DNA電泳條帶未見被血清或DNase Ⅰ消化的片段。在負載和保護基因的機制方面，Arg-nHAP顆粒與多價陽離子聚合物是一致的。荷正電的Arg-nHAP載體與荷負電的DNA通過靜電吸引方式結(jié)合，濃縮DNA縮小整個載體/DNA復(fù)合物體積，從而達到有效結(jié)合并保護DNA免遭核酸酶的破壞。

圖6 Arg-nHAP對DNA保護的凝膠電泳照片F(xiàn)ig.6 Electrophoresis photos showing protection of Arg-nHAP to DNA (M: Marker; 1: pDNA mixed with Arg-nHAP in Dulbecco MEM (DMEM) supplemented with 5% fetal bovine serum; 2: Single pDNA in 5% bovine serum with Dulbecco MEM (DMEM); 3: Single pDNA in 5% fetal bovine serum with Dulbecco MEM (DMEM); 4: Single pDNA in fetal bovine serum)

3 結(jié)論

1) 在水熱合成過程中，添加精氨酸有利于獲得尺寸均勻、形貌傾向于粒狀的納米羥基磷灰石顆粒。

2) 精氨酸表面修飾改變nHAP表面電荷的電性，其Zeta電位由未修飾的(?12.5±6.5) mV變?yōu)樾揎椇蟮?30.9±8.2) mV。

3) 每30質(zhì)量單位的Arg-nHAP可負載至少1個質(zhì)量單位的質(zhì)粒DNA，負載的DNA可抵御核酸酶的溶解。

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(編輯 龍懷中)

Arginine modification and gene binding property of hydroxyapatite nanoparticles

ZHAO Yan-zhong1,2,3, ZHU Shai-hong1,2, TAN Juan2, HUANG Yan-yan2, LI Zhi-you1, ZHOU Ke-chao1,3
(1. State Key Laboratory of Powder Metallurgy, Central South University, Changsha 410083, China;2. The Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410013, China;3. Research Center for Medical Material and Instruments, Central South University, Changsha 410013, China)

TB 39

A

1004-0609(2010)06-1203-06

長沙市科技計劃資助項目(K0905035-11)

2010-01-05；

2010-04-20

周科朝，教授，博士；電話：0731-88830464；E-mail: zhoukechao@mail.csu.edu.cn