細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)黃姜薯蕷皂苷元的分離純化

王 亞 南， 富 瑤 瑤， 王 穎， 魚 紅 閃， 金 鳳 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

黃姜又名盾葉薯蕷[1]，主要活性物質(zhì)為薯蕷皂苷，其學(xué)名為3-O-α-L-鼠李糖-(1→4)-[α-L-鼠李糖-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-薯蕷皂苷元[2]，是生產(chǎn)甾體激素類藥物原料，常用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心腦血管疾病等[3-4]。由于薯蕷皂素的需求量非常大，現(xiàn)有的傳統(tǒng)加工工藝采用黃姜全料酸解，使用的鹽(硫)酸量大，造成污水量大，COD濃度高，并且酸降解的有機(jī)物質(zhì)多，對環(huán)境造成重大污染，因而使用生物法酵解皂苷生產(chǎn)皂素已成為發(fā)展趨勢。劉冰[5]、王元好[6]等分別用真菌sp.D00b、sp.D38b來源的薯蕷皂苷酶在植物體外水解穿山龍薯蕷皂苷，并對酶解產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化，得到3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-薯蕷皂苷元。作者采用細(xì)菌Rhodopseudomonassp.No.18直接對黃姜生藥進(jìn)行發(fā)酵，轉(zhuǎn)化黃姜中的薯蕷皂苷得到薯蕷皂素和低糖基薯蕷皂苷，并對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材 料

黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物，實驗室自制；薯蕷皂苷及薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品，產(chǎn)地陜西；細(xì)菌Rhodopseudomonassp.No.18，韓國KAIST大學(xué)提供；薄層層析板；硅膠。

1.2 方 法

1.2.1 黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物的制備

將黃姜與水按1∶1比例均勻混合，滅菌后接入Rhodopseudomonassp.No.18菌，在30 ℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)4 d。發(fā)酵結(jié)束后用3倍體積的石油醚對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行脫脂，濾掉石油醚；待培養(yǎng)基中殘留石油醚揮發(fā)完全后，向培養(yǎng)基中加入4倍體積的水飽和正丁醇，24 h后過濾，收集濾液。水飽和正丁醇反復(fù)提取3次，濾液濃縮干燥即獲得黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.2 硅膠柱層析法分離黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物

樣品膠的制備：將黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物溶于甲醇，待完全溶解后，緩慢加入適量的80～100目硅膠，不斷攪拌，使發(fā)酵產(chǎn)物與硅膠結(jié)合，置于60 ℃水浴加熱，待溶劑完全揮發(fā)后即得樣品膠。

裝柱：取適量300～400目硅膠作為分離膠。將分離膠緩慢裝入玻璃柱中，真空吸實，使其鋪放均勻。在分離膠上層均勻裝入制備好的樣品膠，樣品膠表面覆蓋脫脂棉。裝柱過程中要注意保持柱子垂直，以及各層硅膠面的水平。

梯度洗脫：裝好的硅膠柱首先通入氯仿通柱，直至色素至分離膠底部,然后依次按照V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1進(jìn)行梯度洗脫。分別收集洗脫液，即可得到薯蕷皂苷單體，TLC檢測分離結(jié)果。洗脫液經(jīng)減壓濃縮，蒸干即得到固態(tài)單體。

1.2.3 薄層層析法檢測黃姜薯蕷皂苷

在薄層層析板上，用微量點樣器吸取標(biāo)準(zhǔn)品，點樣于薄層層析板上。每次點樣依照樣品濃度確定點樣量，每次點樣后需風(fēng)干。將點好樣品的硅膠板放入層析缸的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0 cm(切勿將樣點浸入展開劑中)，密封蓋，待展開至規(guī)定距離(一般為4.5 cm)后，取出，吹干溶劑，噴10%H2SO4水溶液后，加熱顯色。展開劑：V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5(均相)；點樣量：2～5 μL。

1.2.4 HPLC方法測定黃姜酶解產(chǎn)物單體的純度

儀器：高效液相色譜分析儀(Waters Water 490 Programmable UV Detector、Waters 740 Data Module)；色譜柱：Hypersil(R) ODS2反相柱；柱規(guī)格：φ4.6 mm，200 mm；填料：C18，5 μm ；進(jìn)樣量：10 μL；流動相，V(乙腈)∶V(水)=7∶3；均為色譜純。將所需流動相按要求比例配比，即取乙腈350 mL，超濾水150 mL(超濾膜、真空泵抽濾)，混合均勻，用超聲波超20 min除去氣泡；檢測波長：209 nm；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃。樣品預(yù)處理：取樣品1 mg，溶于1 mL甲醇中。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物的制備

根據(jù)“1.2.1”的方法，將黃姜500 g發(fā)酵培養(yǎng)4 d。發(fā)酵后的培養(yǎng)基經(jīng)1 500 mL石油醚脫脂后，用2 000 mL水飽和正丁醇反復(fù)3次提取發(fā)酵產(chǎn)物，收集濾液，濃縮干燥得黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物15.2 g。

2.2 硅膠柱層析法分離黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物

稱取黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物10 g放入瓷碗中，倒入適量甲醇，攪拌使固體粉末充分溶解后，與20 g 80～100目的硅膠均勻混合，使黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物被硅膠吸附，置于60 ℃水浴加熱，待溶劑揮發(fā)盡后即制得樣品膠。稱取300～400目分離膠200 g，裝柱，保持上表面水平，抽真空使之細(xì)密均勻，再裝入干燥好的樣品膠。首先用約500 mL的純氯仿通柱，然后用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的氯仿-甲醇流動相每次200 mL洗脫皂苷，分別收集，TLC法檢測。從第3瓶開始皂苷被洗下，至第21瓶時目的產(chǎn)物薯蕷皂苷元幾乎全被洗下，此時換用極性稍大的V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1的流動相繼續(xù)洗脫，至43瓶時產(chǎn)物Ⅱ幾乎完全被洗下。最后用甲醇將殘余的皂苷完全洗下，TLC 檢測結(jié)果如圖1所示。

S，黃姜薯蕷總皂苷；D，薯蕷皂素；1～48,分離后收集產(chǎn)品的瓶號圖1 發(fā)酵產(chǎn)物分離純化檢測結(jié)果Fig.1 Separation and purification of fermented product on TLC

由圖1可以看到，當(dāng)洗脫液為V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5時，從第3至第17瓶為目的產(chǎn)物薯蕷皂苷元，到21瓶時薯蕷皂苷元已經(jīng)完全洗脫。此時增加洗脫液極性，當(dāng)洗脫液為V(氯仿)∶V(甲醇)= 9∶1時，第22瓶開始出現(xiàn)產(chǎn)物Ⅱ，至42瓶時洗脫完全。

收集產(chǎn)物Ⅰ洗脫液(1～17瓶) 濃縮干燥得到晶狀粉末2 g，得率為20%，收集產(chǎn)物Ⅱ洗脫液(23～36 瓶)，濃縮干燥后得粉末4.2 g，得率為42%。產(chǎn)物Ⅰ為發(fā)酵產(chǎn)物薯蕷皂苷元；產(chǎn)物Ⅱ為分離得到的發(fā)酵副產(chǎn)物皂苷單體，其各洗脫液成分、得率見表1。

2.3 高效液相色譜法測定黃姜薯蕷皂苷發(fā)酵產(chǎn)物的純度

取產(chǎn)物Ⅰ1 mg，溶于1 mL色譜甲醇中，采用HPLC法檢測產(chǎn)物Ⅰ純度，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，樣品Ⅰ的保留時間為23.097 min，峰面積為6 456 675 μV·s,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.9%。由此可知，黃姜薯蕷皂苷元的純度約為96.9%。

表1 黃姜酵解產(chǎn)物洗脫收集表Tab.1 Prepare for the separation of the product

圖2 薯蕷皂苷元的HPLC檢測圖譜Fig.2 The diosgenin on HPLC

3 結(jié) 論

黃姜經(jīng)細(xì)菌直接發(fā)酵法制得粗產(chǎn)物15.2 g。黃姜發(fā)酵產(chǎn)物10 g經(jīng)硅膠柱梯度洗脫分離提純后，得到兩種產(chǎn)物。產(chǎn)物Ⅰ為目的產(chǎn)物黃姜薯蕷皂苷元，收集到硅膠柱分離的單點2 g，得率為20%；利用高效液相色譜對其進(jìn)行純度測定，層析得到的薯蕷皂苷元純度為96.9%。產(chǎn)物Ⅱ為反應(yīng)副產(chǎn)物，收集得4.2 g，得率為42%，其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及理化作用有待進(jìn)一步的研究。綜上可知，經(jīng)細(xì)菌直接發(fā)酵黃姜產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，產(chǎn)物得率不高，其經(jīng)硅膠柱分離純化后，各組分分離較完全，所得單體純度較高。

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