復方咳喘消顆粒液相指紋圖譜研究

鄧力為 倪健 沈小春

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102）

復方咳喘消顆粒由辛夷、金銀花、烏梅、五味子、北葶藶子、鉤藤、半夏、瓦楞子、秦皮等藥味組成，主要用于急、慢性支氣管炎(包括慢支急性發(fā)作)，喘息性氣管炎等的治療。其制備工藝包括醇提、水提兩部分，君藥為辛夷、金銀花。該顆粒劑處方藥味較多，藥量大，而原有質量標準僅針對兩味君藥的指標性成分進行定性、定量分析，難以控制方劑的整體物質群，無法保證制劑的質量。本實驗采用HPLC法對復方咳喘消顆粒指紋圖譜進行研究，以期完善復方咳喘消顆粒的質量標準，同時對顆粒劑、中間提取物（醇提、水提）及處方中的藥材指紋圖譜進行對照分析，闡明顆粒劑指紋圖譜共有峰的來源，為復方制劑的質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

Aglient 1100高效液相色譜儀（在線真空脫機，四元梯度泵，手動進樣器，DAD檢測器）；Hamilton進樣針（25μL）；BP211D 電子天平（德國賽多利斯）；CX-300超聲波清洗機（北京醫(yī)療設備二廠）。

復方咳喘消顆粒 （批號為 061212、070402、070406、070410、070524、070629、070707、070729、070803、070815），由北京中醫(yī)藥大學GMP車間提供；水提浸膏、醇提浸膏（批號為 061212、070402、070406、070410、070524、070629、070707、070729、070803、070815），由北京中醫(yī)藥大學 GMP車間提供；辛夷、金銀花、烏梅、紫菀、五味子、北葶藶子、鉤藤、半夏、瓦楞子、秦皮藥材，購自安國以嶺中藥飲片有限公司，經鑒定各藥均需符合中國藥典2005年版一部項下的有關要求。

木蘭脂素對照品（批號：882-200102）、綠原酸對照品（批號：110753-200413）、五味子醇甲對照品（批號：110857-200406）、秦皮甲素對照品（111731-200501）、秦皮乙素對照品（110741-200506），均購于中國藥品生物制品檢定所。

乙腈（Fisher公司，色譜純），屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 測定條件

色譜柱：依利特 Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸水溶液。流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm。柱溫：室溫；進樣量：10 μL，梯度洗脫條件見2.6.2。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取木蘭脂素、綠原酸、五味子醇甲、秦皮甲素、秦皮乙素對照品適量，用甲醇溶液分別制備成0.1 mg/mL的溶液，即得。

2.3 樣品溶液的制備

取顆粒劑4.0 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 水提（醇提）浸膏溶液的制備

精密稱取水提（醇提）浸膏1.0 g，精密加入甲醇20 mL，按樣品溶液的制備方法制備，即得。

2.5 藥材溶液的制備

精密稱取辛夷、金銀花、烏梅、紫菀、五味子、北葶藶子、鉤藤、半夏、瓦楞子、秦皮藥材適量，精密加入甲醇20 mL，按樣品溶液的制備方法制備，即得。

2.6 色譜分離條件優(yōu)化

2.6.1 流動相系統(tǒng)選擇 比較了流動相：甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現乙腈-水系統(tǒng)分離效果更好，且柱壓較低，選擇乙腈-水系統(tǒng)，并對其進行梯度優(yōu)化。

2.6.2 梯度優(yōu)化 以HPLC指紋圖譜中各峰的分離度為優(yōu)化指標，最終確定如下所示的梯度條件：0 min，乙腈-0.2%磷酸水溶液（5%∶95%）；34 min，乙腈 -0.2%磷酸溶液（10%∶90%）；65 min，乙腈 -0.2%磷酸水溶液（25%∶75%）；79 min，乙腈-0.2%磷酸溶液（45%∶55%）；95 min，乙腈-0.2%磷酸水溶液（53%∶47%）；100 min，乙腈 -0.2%磷酸溶液（5%∶95%）。

2.6.3 檢測波長選擇 在 365 nm、300 nm、280 nm、260 nm、240 nm、210 nm波長下，按照2.1色譜條件進樣分析，結果如圖1。

圖1 復方咳喘消顆粒指紋圖譜波長選擇

由圖可見，240 nm下全方中的指紋峰的峰數和峰強度均優(yōu)于其他波長，因此選擇240 nm作為測定波長。

2.6.4 流動相選擇 考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.15%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.3%磷酸對指紋圖譜中色譜峰分離的影響，結果如圖2。

圖2 復方咳喘消顆粒指紋圖譜流動相選擇

由圖可見，以乙腈-0.2%磷酸為流動相，幾個關鍵色譜峰得以分離，峰形得到改善。結果還表明，0.2%和0.3%磷酸對圖譜的影響不大，考慮到酸度較大，會影響色譜柱壽命，最終選用乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相。

2.6.5 溶劑選擇 分別以甲醇、無水乙醇、60%乙醇作為提取溶劑制備樣品，考察對所得指紋圖譜峰數及峰形的影響。結果顯示：三者作為溶劑制備樣品，對指紋圖譜各峰的影響很小，故選擇黏度最低的甲醇作為溶劑。

2.7 方法學考察

2.7.1 精密度試驗 取供試品溶液（批號070815）連續(xù)進樣6次，測得指紋圖譜共有峰45個，各共有峰相對保留時間RSD＜1%，相對峰面積RSD＜3%。

2.7.2 重復性試驗 取復方咳喘消顆粒（批號070815）各6份進行測定，分別進樣，測得各共有峰相對保留時間RSD＜1%，相對峰面積RSD＜3%。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（批號070815）分別在0、6、12、24、36、48 h 進樣，測得各共有峰相對保留時間RSD＜1%，相對峰面積RSD＜3%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.8 指紋圖譜及技術參數

2.8.1 指紋圖譜 采用“2.1測定條件”項下方法測定10批樣品，得到指紋圖譜，見圖3。根據10批樣品指紋圖譜提供的各種相關參數，確認樣品中所有化學成分的色譜峰在100 min內全部出完。

2.8.2 共有指紋峰的標定及其峰形與峰貌描述 比較上述各色譜峰，發(fā)現在240 nm檢測波長下，有45個峰或峰組是共有的，確認為共有指紋峰。

圖3 復方咳喘消顆粒HPLC指紋圖譜

2.8.3 共有指紋峰相對保留時間及峰面積比值 在240 nm檢測波長下，以峰面積較大、分離度好、保留時間近中間的18號峰為參照峰，以其保留時間和峰面積作為1，分別計算其他各共有指紋峰的相對保留時間和峰面積比值（峰面積比值計算時，僅限于峰面積占總峰面積大于2%者），得到樣品的指紋圖譜的相關技術參數，結果見表1。各特征指紋峰的相對峰面積、相對保留時間均具有較好的重現性，特征指紋峰的相對保留時間RSD＜1%，相對峰面積RSD＜3%。

2.8.4 相似度計算 使用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”，將1～10批次咳喘消顆粒圖譜數據導入，經多點校正和數據匹配，以中位數法生成對照指紋圖譜。10批復方咳喘消顆粒的相似度分別為0.992、0.973、0.969、0.972、0.984、0.984、0.981、0.985、0.973、0.990，具有較好的相關性，見圖4。

表1 各共有峰的相關參數

2.9 指紋圖譜少量色譜峰的指認

分別吸取一定量2.2制備的對照品溶液加入到樣品溶液中，按照“2.1測定條件”項下方法測定指紋圖譜，與未加對照品溶液的樣品指紋圖譜進行比較，通過色譜峰峰高或峰面積的增加，對指紋圖譜共有化學成分進行確認，其中6號峰為秦皮甲素、10號峰為秦皮乙素、11號峰為綠原酸、37號峰為木蘭脂素、39號峰為五味子醇甲。

圖4 復方咳喘消顆粒指紋圖譜相似度評價

2.10 指紋圖譜共有指紋峰與相應提取部位指紋圖譜的相關性

分別取2.4制備的水提（醇提）浸膏溶液（批號為061212、070402、070406、070410、070524、070629、070707、070729、070803、070815），按照“2.1 測定條件”項下方法測定，得各提取部位指紋圖譜，并與樣品指紋圖譜進行比較，結果見圖5、圖6。

圖6 復方咳喘消顆粒水提部位HPLC指紋圖譜

由圖可知，水提部位指紋峰多集中于指紋圖譜0～80 min段，而醇提部位指紋峰多集中于指紋圖譜80～100 min段，水提物質極性較大先出峰，且說明處方中水提物質比重較大。

2.11 指紋圖譜共有指紋峰與處方藥材相應部位指紋圖譜的相關性

分別取2.5制備的藥材溶液，按照“2.1測定條件”項下方法測定，得到處方中各藥材指紋圖譜。見圖7。

將各藥材圖譜與樣品指紋圖譜進行比較，根據對各色譜峰的保留時間、峰形等的考察，對指紋圖譜共有指紋峰與處方藥材相應部位指紋圖譜的相關性進行分析確認。結果見表2。

3 討論

圖7 復方咳喘消復方各藥材HPLC指紋圖譜

表2 指紋圖譜共有色譜峰來源

3.1 復方咳喘消顆粒為復方制劑，成分較多，未對各色譜峰化學成分一一歸屬確認，僅給出6號峰（秦皮甲素）、10號峰（秦皮乙素）、11號峰（綠原酸）、37號峰（木蘭脂素）、39號峰（五味子醇甲）的歸屬。

由歸屬分析可得出各色譜峰的藥材來源，處方中十味藥材均對復方有所貢獻，并有一個色譜峰對應兩種或者三種藥材歸屬的情況。君藥金銀花對應13組色譜峰，辛夷對應14組色譜峰，亦說明君藥在處方中比重較大，具備相應的物質基礎。同時建立了顆粒醇提部位及水提部位的指紋圖譜，也對中間提取物的質量起到一定控制作用[1]。

3.2 用于判斷復方咳喘消顆粒質量穩(wěn)定性時，一方面通過圖譜的直觀比較，能夠反映出各共有峰的有無及大致比例，從而判斷其質量一致性的情況；另一方面通過計算相對保留時間及相對峰面積，判斷是否符合所建立的指紋圖譜的技術參數[2-3]。另外可通過峰面積對各指標成分進行定量，同時，采用藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對樣品數據進行處理，相關系數不得低于0.90，以此制定復方咳喘消顆粒真?zhèn)舞b別及質量評價的標準。

3.3 指紋圖譜與中藥有效成分的復雜性、不確知性，以及發(fā)揮作用時眾多成分的協同性、多靶點性特點相吻合[4]。復方咳喘消顆粒的HPLC指紋圖譜，可作為控制其質量的定性指標，為處方中各味藥材發(fā)揮臨床療效提供一定的物質基礎保障。

[1]王新宏,安睿.數字化色譜指紋圖譜技術在雙黃連制劑質量及藥材鑒定中的應用[J].中草藥,2002,33（2）：115-118.

[2]沙明,曹愛民.HPLC指紋圖譜技術在中藥新藥質量控制的應用[J].中草藥,2002,33(2):181-183.

[3]胡柳,欒連軍.復方有效部位與組方藥材指紋圖譜色譜峰相關性研究[J].中國藥學雜志,2004，39（12）：895-902.

[4]聶晶,田頌久,王國榮.中藥指紋圖譜的研究現狀[J].中國中藥雜志,2000,31(12):881-890.