STK33基因在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的臨床研究

呂東津 許哲源 王平 彭浩 彭俊 熊健

昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院，云南省第一人民醫(yī)院胸外科，云南 昆明650032

肺癌目前是世界范圍內(nèi)發(fā)生率和病死率最高的惡性腫瘤［1］，其中85%都是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。研究證實(shí)EGFR通路在腫瘤（其中就包括了NSCLC）的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，以EGFR為靶標(biāo)的分子靶向藥物的出現(xiàn)為肺癌的治療帶來(lái)了新的希望和手段，以吉非替尼（Gefitinib，ZD1839，易瑞沙，阿斯利康公司）和厄洛替尼（Erlotinib，OSI-774，特羅凱，羅氏公司）為代表的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）是目前被多國(guó)批準(zhǔn)并被廣泛應(yīng)用于進(jìn)展或難治性NSCLC的小分子靶向藥物［2］。但是隨著時(shí)間的推移，研究發(fā)現(xiàn)K-ras基因突變與肺癌患者對(duì)TKI藥物的原發(fā)耐藥有關(guān)。大量的臨床試驗(yàn)也證明了與K-ras未突變患者相比，K-ras突變患者對(duì)EGFR抑制劑不太可能有明顯的療效［3-5］。最近Scholl等［6］研究發(fā)現(xiàn)與突變K-ras基因依賴的相關(guān)腫瘤細(xì)胞系中，通過(guò)抑制STK33能產(chǎn)生綜合致死效應(yīng)，而對(duì)于那些非K-ras依賴的細(xì)胞系卻沒(méi)有作用。因此，推測(cè)通過(guò)抑制STK33這一新思路能巧妙地解決部分NSCLC患者TKI耐藥性的困境。

STK33，一種新的絲氨酸/蘇氨酸激酶基因（a novel serine/threonine kinase gene，STK33），定位于人類染色體 11p15.3區(qū)域［7-8］，盡管經(jīng)過(guò)與其他激酶的序列比較，其被確定為鈣調(diào)節(jié)蛋白家族（CAMK）的一員［9-11］，但是，目前對(duì)于STK33的生化特性和生物功能都不是很清楚。本研究采用Real-time qPCR法及Western blot蛋白印跡法對(duì)24例經(jīng)病理確診的NSCLC病例中的癌組織、遠(yuǎn)癌組織中及9例肺良性病變的STK33表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，探討STK33在NSCLC中的表達(dá)規(guī)律，及其在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 資料來(lái)源 收集2009年4—9月在云南省第一人民醫(yī)院心胸外科接受診斷和治療的NSCLC肺癌患者24例。所有患者均經(jīng)手術(shù)病理確診，且資料完整、術(shù)前未接受任何相關(guān)放化療。其中男性14例，女性10例；年齡范圍39～74歲，平均年齡（57±5）歲。對(duì)照組采用同一患者的遠(yuǎn)癌組織（距腫瘤活檢切除邊緣外3～6 cm的組織）和9例肺良性病變組織，其中炎性假瘤5例，結(jié)核2例，淋巴網(wǎng)狀組織非典型增生1例，良性腫瘤1例。

1.2 儀器和試劑 電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)（Bio Rad公司），7500 fsat PCR儀器（ABI公司）。高純總RNA快速提取試劑盒、氯仿（Bioteke公司），dNTP Mix（上海生工），Jump Start Taq DNA Polymerase（Sigma公司），SYBR GREENⅠ染液（Amresco Inc），Ribo nuclease Inhibitor、DNaseⅠ（RNase-free）、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（promega）、100 bp DNA Ladder（Tiangen公司），引物有看家基因β-actin、目的基因STK33（上海生工公司合成）。抗actin一抗、抗STK33一抗（Abcam公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），PMSF（上海生工公司），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（鼎國(guó)生物公司），化學(xué)發(fā)光檢測(cè)底物試劑盒（Pierce公司），膠片（柯達(dá)有限責(zé)任公司），PVDF膜（Millipore 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織總RNA的抽提 ⑴勻漿處理：提前把1 mL試劑盒中配的裂解液加入到用1‰DEPC處理過(guò)的1.5 mL離心管中，從液氮灌中取米粒大小組織裝入冰凍的研缽，并加入少許液氮到研缽中，盡量研磨組織使其成冰凍的粉末狀，保持液氮不完全蒸發(fā)，并用移液槍挑入1.5 mL離心管，同時(shí)輕輕吹打混勻。⑵將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15～30 ℃條件下溫育5 min以使核蛋白完全分解。⑶4 ℃的條件下12 000 r/min離心10 min，小心取上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase free的離心管中。⑷每1 mL裂解液加0.2 mL氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈震蕩15 s并將其在室溫下溫育3 min。⑸于4 ℃12 000 r/mim離心10 min，樣品會(huì)分成3層：下層為有機(jī)相，中間層和上層為無(wú)色的水相，RNA存在于水相中，水相層的容量大約為所加裂解液體積的60%，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進(jìn)行下一步操作。⑹加入1倍體積70%乙醇，顛倒混勻，得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱中。⑺10 000 r/min 離心45 s，棄掉廢液，將吸附柱重新套回收集管。⑻加500 μL 去蛋白液，12 000 r/min 離心45 s，棄掉廢液。⑼加入700 μL 漂洗液，12 000 r/min 離心60 s，棄掉廢液。⑽加入500 μL漂洗液，12 000 r/min離心60 s，棄掉廢液。⑾將吸附柱放回空收集管中，12 000 r/min 離心2 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。⑿取出吸附柱，放入1個(gè)無(wú)RNA水解酶的離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA 產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加入50～80 μL無(wú)RNA水解酶水解，于室溫下放置2 min，12 000 r/min 離心1 min。

1.3.2 測(cè)A值定量RNA濃度和電泳檢測(cè)RNA完整性 ⑴紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量：在比色杯中加98 μL DEPC處理過(guò)的雙蒸水，再加入2 μL樣品，測(cè)定A260/A280值，計(jì)算：RNA濃度（μg/μL）=A×0.33×稀釋倍數(shù)（50）。⑵分析RNA樣品的純度：1.9≤A260/A280≤2.1為純RNA，A260/A280≥2.0為無(wú)鹽污染。⑶RNA完整性檢測(cè)：被提取后的RNA的完整性通過(guò)凝膠電泳來(lái)證實(shí)。1.2%的瓊脂糖凝膠，以0.5 μg/mL溴化乙錠染色。取1 μL RNA，加入9 μL DEPC H2O及1 μL上樣緩沖液，混勻后上樣，電泳（60 V，0.5×TBE）40 min，凝膠成像儀檢測(cè)。

1.3.3 消化基因組DNA 將42.3 μL RNA（＜25μg）、5 μL 10×buffer、2 μL DNase Ⅰ（5 U/μL）、0.7 μL RNase抑制劑（40 U/μL）混合，于37 ℃消化30 min，加入2 μL 0.5 mol/L EDTA 72 ℃，10 min滅活DNaseⅠ。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成 ⑴取≤4.0 μg的總RNA，分別加入2.5 μL 6base隨機(jī)引物（100 μmol）和2.5 μL 9base隨機(jī)引物（100 μmol），和/或0.5 μL oligo-dT（100 μmol），充分混勻之后，70 ℃，6 min使RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)延展，然后立即置于冰上2 min以上，使隨機(jī)引物和/或oligo-dT引物和RNA模板充分結(jié)合。⑵向上述混合體系中加入10 μL 5×的逆轉(zhuǎn)錄buffer，加入2.5 μL dNTP（10 mmol/L），加入400 U的逆轉(zhuǎn)錄酶，加入30 U的RNase抑制劑后置于37 ℃，90 min以上，完成逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.5.1 熒光定量PCR 體系 10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL（10 mmol/L），正向引物：0.5 μL（10 pmol/μL），反向引物：0.5 μL（10 pmol/μL），20× SYBR GREENⅠ 0.5 μL（終濃度為0.2倍），模板：DNA 1 μL，Jumpstart Taq DNA聚合物0.4 μL（1.25 U），加入dH2O（滅菌蒸餾水）至25.0 μL。

1.3.5.2 實(shí)時(shí)定量PCR引物 β-actin序列，F(xiàn)：5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；R：5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3’。STK33序列，F(xiàn)：5’-GGTGGATCATTCAAAGTCTCGC-3’；R：5’-GCTAAGCCAAAATCAGTCACCTT-3’。

1.3.5.3 循環(huán)條件 95 ℃預(yù)變性30 s， 95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸共30 s，擴(kuò)增共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本平行檢測(cè)3次，PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。β-actin作為內(nèi)參， H2O作為PCR的陰性對(duì)照，檢測(cè)樣品單一的溶解曲線峰及瓊脂糖凝膠電泳單一條帶為特異性擴(kuò)增。

1.3.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR產(chǎn)物鑒定及定量分析 ⑴產(chǎn)物鑒定：包括熔解曲線分析和2%瓊脂糖凝膠電泳。3個(gè)平行樣本的熔解曲線只產(chǎn)生一個(gè)熔解峰即表明產(chǎn)物是唯一的，結(jié)合2%瓊脂糖凝膠電泳可進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物的特異性，以DNA分子量標(biāo)記物為參照，可證明產(chǎn)物片斷大小與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。⑵通過(guò)下列公式定量分析：

△CT（sample）=CT target gene-CT reference gene

△CT（calibrator）=CT target gene-CT reference gene

CT值（cycle threshold）代表循環(huán)閾值，指PCR擴(kuò)增過(guò)程中，目的基因cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)超過(guò)基線值（進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期）時(shí)的循環(huán)數(shù)，目的基因起始拷貝數(shù)越多，達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增所需循環(huán)數(shù)越少，即CT值越小。將各樣本的CT值與該樣本擴(kuò)增β-actin時(shí)的CT值代入公式，即得到各樣本STK33的相對(duì)表達(dá)量，用△CT值表示。（注：△CT值越小表示該基因在組織中的表達(dá)越高）。Sample（樣本）：肺癌患者的癌組織；Calibrator（對(duì)照）：遠(yuǎn)癌組織和良性病變患者的肺組織；Target gene（靶基因）：STK33；Reference gene（參照基因）：β-actin。

1.3.6 Western blot蛋白印跡

1.3.6.1 肺組織總蛋白提取 ⑴取米粒大小標(biāo)本肺組織，置于液氮預(yù)冷的研缽中，在液氮中盡量研碎。⑵棄上清液后用PBS重復(fù)洗滌一次。用槍吸干上清液后，向預(yù)冷粉末狀標(biāo)本肺組織中加入適量RIPA裂解液，其主要成分為50 mmol/L Tris （pH=7.4），150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，以及EDTA。冰上裂解30 min，裂解過(guò)程中要以漩渦震蕩器震蕩，以使肺組織充分裂解。⑶4 ℃、12 000 r/min離心15～20 min，取上清液分裝于0.5 mL離心管中并置于－20 ℃保存。⑷取出蛋白裂解液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒蛋白濃度，加入5×還原型上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。

1.3.6.2 SDS-PAGE電泳 ⑴制備分離膠：分離膠的高度要合適，要保證蛋白在壓縮膠里的行程不少于1 cm。當(dāng)把丙烯酰胺分離膠倒鑄之后，用去離子水封閉分離膠，以達(dá)到使分離膠水平的目的，同時(shí)可以防止空氣對(duì)于丙烯酰胺的聚合抑制。⑵待分離膠凝聚，除去分離膠表面的去離子水，然后制備壓縮膠。⑶待到壓縮膠凝聚之后，在電泳槽中加入電泳緩沖液。拔取制膠梳子。⑷對(duì)于每個(gè)上樣孔，上樣20 μg或100 μg總蛋白，壓縮膠階段，以60 V電壓進(jìn)行電泳。待溴芬蘭條帶（即蛋白條帶）過(guò)了壓縮膠和分離膠的分界線之后，可以加高電壓以縮短電泳時(shí)間。但是，過(guò)高的電壓會(huì)導(dǎo)致發(fā)熱加快，同時(shí)，也會(huì)使電泳條帶變得不規(guī)則。⑸根據(jù)marker的位置，決定電泳的時(shí)間。待到合適時(shí)間，結(jié)束電泳。取出分離膠部分進(jìn)行考馬斯R250染色，或者進(jìn)行Western blot的蛋白轉(zhuǎn)印。⑹在蛋白電泳結(jié)束前約半小時(shí)，將PVDF膜用甲醇完全浸濕至半透明狀，然后用去離子水漂洗2 min。將漂洗過(guò)的PVDF膜放置于轉(zhuǎn)移緩沖液中，浸泡最少10 min以上。⑺在浸泡PVDF膜的同時(shí)，將上下兩層濾紙都進(jìn)行浸泡。⑻將電泳結(jié)束后的分離膠放置于轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡10～15 min。⑼上下兩層濾紙與分離膠還有PVDF膜的大小規(guī)定如下：下層濾紙=PVDF膜=凝膠＞上層濾紙。⑽待到凝膠平衡時(shí)間足夠后，將下層濾紙放置于轉(zhuǎn)印裝置的正極，用玻棒攆出濾紙中的氣泡。置PVDF膜于下層濾紙上，玻棒適度擠壓。放置分離膠于PVDF膜上，玻棒適當(dāng)擠壓，切忌把分離膠壓破，放置上層濾紙于凝膠之上，玻璃棒輕輕擠壓出氣泡。之后，確定濾紙及膠層和膜之間沒(méi)有氣泡。加上轉(zhuǎn)印裝置的負(fù)極。以恒流（50 mA）或者恒壓（20 V）進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印的強(qiáng)度與時(shí)間為1 mA/cm2不超過(guò)1.5 h。⑾待轉(zhuǎn)印完畢，取出凝膠和PVDF膜。將凝膠進(jìn)行考馬斯亮蘭R250染色，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)印完全與否。將PVDF膜在洗脫液0.2% Tween 20 in trisbuffered saline （TBST）中漂洗，4×10 min。⑿待PVDF膜漂洗完畢之后，加入封閉液進(jìn)行封閉，4 ℃過(guò)夜。

1.3.6.3 免疫顯色 ⑴將封閉過(guò)的PVDF膜進(jìn)行漂洗，4×10 min。⑵用封閉液稀釋抗STK33一抗或抗β-Actin一抗，將漂洗過(guò)的PVDF膜放置于其中溫育，室溫（當(dāng)室溫低于25 ℃時(shí)，于37 ℃）溫育1.5 h。⑶將一抗反應(yīng)后的PVDF膜進(jìn)行漂洗，4×10 min。⑷用封閉液稀釋二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗），將漂洗過(guò)的PVDF膜放置于其中孵育，室溫（當(dāng)室溫低于25 ℃時(shí)，于37 ℃）溫育40 min。⑸將二抗反應(yīng)后的PVDF膜進(jìn)行漂洗，4×10 min。⑹以下步驟在暗室中進(jìn)行，將底物反應(yīng)液混合配制好，將PVDF膜放置于內(nèi)，反應(yīng)10～20 min。⑺將PVDF膜放置暗盒中，壓緊暗盒，曝光時(shí)間5～10 min。⑻打開(kāi)暗盒，將經(jīng)過(guò)曝光的膠片在顯影液中輕柔漂洗，當(dāng)目的條帶出現(xiàn)之后，立即用清水沖洗，將膠片放置于定影液中漂洗1 min。所有膠片都經(jīng)過(guò)掃描，采用Image J軟件進(jìn)行定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用±s 表示；均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和 WB結(jié)果

2.1.1 總RNA純度和完整性鑒定 ⑴實(shí)驗(yàn)中所抽提總RNA A260/A280值均在1.74～2.05之間，表明純度較高。⑵1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色可見(jiàn)28 S和18 S兩條主帶清晰，比值接近為2∶1，無(wú)拖尾降解現(xiàn)象發(fā)生。表明總RNA完整性較好，基本無(wú)降解（圖1）。

2.1.2 PCR產(chǎn)物鑒定 2%瓊脂糖凝膠電泳：將實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物的特異性及驗(yàn)證產(chǎn)物片段大小。β-actin和STK33擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分別是181和160 bp（圖2）。

圖1 NSCLC組和對(duì)照組組織總RNA凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel eletrophoretogram of the total RNA in NSCLC group and control group

2.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)STK33 mRNA表達(dá)情況的結(jié)果分析

2.1.3.1 NSCLC患者肺癌組織和遠(yuǎn)癌組織中STK33 mRNA的表達(dá)情況 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，NSCLC患者肺癌組織、遠(yuǎn)癌組織中STK33平均ΔCT值分別為8.7±2.0，9.7±1.4。NSCLC患者肺癌組織STK33基因表達(dá)量高于遠(yuǎn)癌組織，且兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P＜0.05，表 1）。

表1 肺癌患者肺癌組織和遠(yuǎn)癌組織中STK33水平Tab.1 Expression level STK33 gene in cancer tissues and distal cancerous tissues of patients with lung cancer(±s)

表1 肺癌患者肺癌組織和遠(yuǎn)癌組織中STK33水平Tab.1 Expression level STK33 gene in cancer tissues and distal cancerous tissues of patients with lung cancer(±s)

2.1.3.2 NSCLC患者肺癌組織與肺良性病變患者組織中STK33 mRNA的表達(dá)情況 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，NSCLC患者肺癌組織與良性病變患者組織中STK33平均ΔCT值分別為8.7±2.0和10.5±0.9。NSCLC患者肺癌組織STK33基因表達(dá)量高于肺良性病變組織，且兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 2）。

圖2 NSCLC和對(duì)照組組織中β-actin、STK33 real-time RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel eletrophoretogram of real-time RT-PCR products of actin, STK33 in NSCLC and control group tissues

表2 肺癌患者肺癌組織與良性病變患者組織中STK33水平Tab.2 Expression level STK33 gene in tissues of patients with lung cancer and lung benign disease(±s)

表2 肺癌患者肺癌組織與良性病變患者組織中STK33水平Tab.2 Expression level STK33 gene in tissues of patients with lung cancer and lung benign disease(±s)

Group n STK33△CT P Distal cancerous group 24 8.7±2.0 Lung benign disease group 9 10.5±0.9 0.001

2.1.3.3 NSCLC患者組織中STK33 mRNA表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 t檢驗(yàn)及單因素方差分析顯示，STK33 mRNA的表達(dá)量與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05，表3）。

2.2 蛋白印跡法檢測(cè)STK33蛋白表達(dá)情況的結(jié)果分析 灰度分析結(jié)果顯示STK33在NSCLC患者的肺癌組織中的蛋白表達(dá)，明顯高于遠(yuǎn)癌組和肺良性病變組（圖3、4）。

3 討 論

腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中往往有著多重復(fù)雜的遺傳和后天的異常改變，盡管存在著這種復(fù)雜性，有些腫瘤的形成和存活總是傾向于被某一特定的癌基因所驅(qū)動(dòng)［12］。因此當(dāng)我們滅活或鈍化這一特定癌基因，就可以影響到腫瘤細(xì)胞的存活、分化、阻滯或者衰老。這體現(xiàn)了腫瘤靶向治療方法的核心概念就是在腫瘤形成的癌基因網(wǎng)絡(luò)中，尋找到關(guān)鍵點(diǎn)加以抑制，使其整個(gè)系統(tǒng)崩潰，并最大程度地保護(hù)正常細(xì)胞［13］。

但是實(shí)際情況，很多針對(duì)癌基因的靶向治療，其臨床療效并不樂(lè)觀。原因在于腫瘤的發(fā)生、演變過(guò)程是多因素、多通路、多階段的復(fù)雜過(guò)程。盡管如此，其中有一個(gè)誤區(qū)仍需要澄清，并不是所有與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因和通路都是固有致癌的［14］。值得注意的一點(diǎn)就是，相對(duì)于正常組織細(xì)胞來(lái)說(shuō)，這些非致癌的基因和通路對(duì)于維持腫瘤發(fā)生、發(fā)展是不可或缺的。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，當(dāng)腫瘤發(fā)生、發(fā)展所需要的癌基因異常時(shí)，腫瘤細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)后備的非癌基因，以維持其活性。隨即腫瘤細(xì)胞對(duì)非癌基因產(chǎn)生依賴性的現(xiàn)象，稱之為非癌基因成癌（non-oncogene addiction，NOA）。這樣一來(lái)，干擾這些基因可能為腫瘤靶向治療提供了新的機(jī)會(huì)［15］。

表3 肺癌患者STK33 mRNA的表達(dá)量與肺癌的臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between expression level STK33 gene and clinical pathology characteristics in the lung cancer tissues

圖3 Western blot 比較肺癌組織、遠(yuǎn)癌組織和肺良性病變組織中STK33和β-actin蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expression of STK33 and β-actin protein in NSCLC cases group, distal cancerous tissues group and lung benign disease cases group detected by Western blot

圖4 灰度分析所得NSCLC、遠(yuǎn)癌組組織和肺良性病變組織中STK33灰度值與相應(yīng)組織中的β-actin的灰度值比較Fig.4 Expression of STK33 protein and β-actin in NSCLC cases group, distal cancerous tissues group and lung benign disease cases group using gray intensity analysis

在這樣的理論背景下，Scholl等［6］研究發(fā)現(xiàn)與突變的K-ras基因依賴的相關(guān)腫瘤細(xì)胞系中，通過(guò)抑制STK33能產(chǎn)生綜合致死效應(yīng)，而對(duì)于那些非K-ras依賴的細(xì)胞系卻沒(méi)有作用。同時(shí)通過(guò)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系、人體骨髓和末梢血標(biāo)本的研究進(jìn)一步指出，STK33沒(méi)有出現(xiàn)類似癌基因表現(xiàn)般的結(jié)構(gòu)異常，且在K-ras突變和不突變不同背景下的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。提示STK33是作為非癌基因發(fā)揮功效的，這點(diǎn)和上文提到的非癌基因成癮的理念是一致的。而且最近一些研究表明某些非癌基因?qū)τ谀承┨囟ǖ哪[瘤類型有特異性，如多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌［16-18］。這可能反映了不同細(xì)胞譜系對(duì)生長(zhǎng)和生存的不同需要。提示在NSCLC中尤其存在K-ras突變的背景下，非癌基因STK33對(duì)于肺癌的發(fā)生、發(fā)展會(huì)不會(huì)也有特異性呢？即使不是特異性，NSCLC的發(fā)生、發(fā)展對(duì)于非癌基因STK33的依賴性也應(yīng)值得注意。Scholl等［6］的研究就巧妙地解決了TKI耐藥性的困境。我們可以想象STK33抑制劑作為一種治療策略來(lái)干預(yù)K-ras突變的NSCLC患者的美好前景。而我們研究工作的意義就在于初步解決了TKI耐藥性的基礎(chǔ)問(wèn)題，即NSCLC的發(fā)生、發(fā)展需要STK33的參與。

本研究著手探討STK33在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義頗具針對(duì)性。本項(xiàng)目中我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法來(lái)檢測(cè)STK33 mRNA在NSCLC中的表達(dá)。研究觀察到NSCLC患者肺癌組織中STK33基因mRNA平均相對(duì)表達(dá)量高于遠(yuǎn)癌組織和肺良性病變中STK33基因的表達(dá)水平。那么STK33基因在肺癌組織與對(duì)照組之間的這種差異性表達(dá)提示STK33在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中的影響不容忽視。接著，我們進(jìn)一步在NSCLC患者肺癌組織和對(duì)照組織中的STK33基因表達(dá)量存有差異的樣本中，應(yīng)用Western blot法來(lái)驗(yàn)證STK33蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌組織、遠(yuǎn)癌組織和肺良性病變組織中STK33蛋白表達(dá)也存在差異。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示著STK33基因與肺癌發(fā)生、發(fā)展之間有密切關(guān)聯(lián)。同時(shí)結(jié)合臨床病理數(shù)據(jù)分析顯示，STK33 mRNA的表達(dá)量與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都無(wú)關(guān)（P＞0.05），提示STK33能否作為肺癌的重要分子標(biāo)志物還需進(jìn)一步研究，因此我們將繼續(xù)深入探索相關(guān)的未知領(lǐng)域。值得注意的是，以60歲分界的高年齡組與低年齡組之間有差異的趨勢(shì)，但這種差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體原因有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步揭示了STK33與NSCLC之間潛在的密切關(guān)聯(lián)。為干擾STK33從而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的研究路線提供了理論支持。為腫瘤靶向治療位點(diǎn)的巧妙選擇，非癌基因成癮現(xiàn)象的靈活實(shí)踐提供了新思路。

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