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    HPLC法測定人血漿中來曲唑濃度及人體相對生物利用度

    2010-09-20 02:34:26趙玉婷徐世希王勝峰周彥彬冉黎靈丁勁松
    中國醫(yī)藥指南 2010年4期
    關(guān)鍵詞:曲唑內(nèi)標(biāo)制劑

    趙玉婷 徐世希 王勝峰 周彥彬 田 娟 冉黎靈 左 英 丁勁松*

    中南大學(xué)藥學(xué)院(410013)

    來曲唑是人工合成的第3代非甾體類高選擇性芳香化酶抑制劑[1],通過與細(xì)胞色素P450芳香化酶中亞鐵血紅素的鐵原子結(jié)合,競爭其活性位點并抑制該酶活性,從而減少雌激素的生物合成[2]。臨床上主要用于雌激素依賴性疾病,如婦女絕經(jīng)期乳腺癌[3]和不孕癥[4]的治療。目前,生物介質(zhì)中來曲唑的測定方法有高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography,HPLC)[5,6]、酶免疫分析法[7]和高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等。酶免疫分析法在分析過程中會生成很多交聯(lián)反應(yīng)代謝物影響其準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性;高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀器普及難度大,不適于多數(shù)實驗室采用;HPLC法具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、成本較低等優(yōu)點,是檢測來曲唑濃度的常用方法。本實驗成功建立了測定人體血漿樣品中來曲唑濃度的HPLC-UV法,并通過比較分析來曲唑分散片和來曲唑片在健康受試者體內(nèi)的藥動學(xué)特征,評價其相對生物利用度及二者的生物等效性,從而為來曲唑分散片的臨床合理用藥提供重要依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    島津LC-2010C高效液相色譜儀;LC-Solution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);TGL16M臺式高速冷凍離心機(jī)(長沙英泰儀器有限公司) ;AB-265S型分析天平(日本梅特勒);WH-2微量旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

    來曲唑?qū)φ掌罚ū本┑卤娙f全藥物技術(shù)開發(fā)有限公司提供,批號:070322,含量:99.75%);咪唑斯汀對照品(三九醫(yī)藥股份有限公司提供,批號:20070307,含量:99.6%);磷酸二氫鉀(廣東汕頭市西隴化工廠,批號:060612),乙腈(色譜純,TEDIA);其他試劑均為國產(chǎn)分析純(AR級);所有試驗用水均為超純水。

    1.2 貯備液的配制

    來曲唑貯備液:精密稱取來曲唑?qū)φ掌?.04977g(相當(dāng)于來曲唑0.04965g)于50mL容量瓶中,用無水乙醇溶解并定容至刻度(0.9929mg/mL)。置于-4℃冰箱中保存,使用時稀釋至所需濃度。

    內(nèi)標(biāo)貯備液:精密稱取咪唑斯汀對照品0.01002g于50mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度(0.20mg/mL)。置于-4℃冰箱中保存,使用時稀釋至所需濃度(1.0μg/mL)。

    1.3 色譜條件

    色譜柱:迪馬 Diamonsil C18柱(4.6mm×200mm,5μm);柱溫:30℃;流動相:乙腈∶磷酸二氫鉀溶液=41∶59(v/v);流速:1.0mL/min;檢測波長:239nm。

    1.4 血漿樣品處理

    精密吸取血漿1.0mL,置10mL具塞尖底玻璃離心管中,加入內(nèi)標(biāo)溶液(1.0μg/mL咪唑斯汀溶液)100μL,渦漩混勻,加入4mL乙醚,渦旋3min,2000r/min離心5min,轉(zhuǎn)移有機(jī)相至另一支干燥的10mL具塞尖底玻璃離心管中,40℃水浴氮氣吹干,殘渣用流動相100μL復(fù)溶,進(jìn)樣20μL。

    1.5 給藥與血樣采集

    本試驗經(jīng)中南大學(xué)藥學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。18名健康男性受試者,年齡為19~24歲,體質(zhì)量61~72kg,在簽署知情同意書并體檢合格后納入試驗。受試者隨機(jī)分成兩組,禁食12h后,于次日晨分別空腹口服來曲唑分散片或來曲唑片2.5mg,在給藥前(0h)和給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2、4、8、12、24、48、96、144h 從肘靜脈取血5mL,3周后交叉服藥,取血方法和時間點同前1周期。采集的血樣標(biāo)本置于肝素化試管中,立即離心分離血漿,-20℃保存至測定。

    1.6 藥物動力學(xué)參數(shù)的計算和統(tǒng)計學(xué)處理

    參數(shù)Tmax和Cmax為實測值,AUC0-t用梯形面積法計算,消除速率常數(shù)K和t1/2用血藥濃度-時間曲線尾端(消除相)數(shù)據(jù)直線回歸計算。AUC0-t、Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行藥物間、周期間、個體間的3個因素方差分析,再以雙向單側(cè)t檢驗進(jìn)行生物等效性評價,Tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1 色譜行為

    在選定的色譜條件下,來曲唑與內(nèi)標(biāo)及血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)分離良好,來曲唑和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為6.8和8.0min,峰形良好??瞻籽獫{、來曲唑和內(nèi)標(biāo)對照品、空白血漿中加入來曲唑和內(nèi)標(biāo)對照品、受試者服藥后血漿樣品的色譜圖見圖1。

    圖1 空白血漿(A)、來曲唑(1,2000μg/L)和內(nèi)標(biāo)(2)對照品(B)、來曲唑(49.6μg/L)和內(nèi)標(biāo)加入空白血漿基質(zhì)中(C)和受試者口服受試制劑1.5h后的血漿樣本加入內(nèi)標(biāo)后色譜圖(36.36μg/L)(D)

    2.2 線性范圍和定量下限

    精密吸取空白血漿1.0mL,置10mL具塞尖底玻璃離心管中,分別加入來曲唑貯備液,配制成來曲唑濃度為2.48、3.10、6.20、12.40、24.80、49.60、99.20μg/L的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,渦旋1min,混勻,按“血漿樣品處理”項操作,記錄色譜圖。以測得的來曲唑峰面積A與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai比值對來曲唑血藥濃度C(μg/L)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為A/Ai=0.0570×C+0.0925 (r=0.9994)。血漿中來曲唑濃度在2.48~99.2μg/L范圍內(nèi)與峰面積比線性關(guān)系良好,其最低定量濃度為2.48μg/L。

    2.3 萃取回收率

    配制濃度為2.48、6.20、12.40、49.6μg/L的來曲唑無水乙醇液和1.0μg//mL的咪唑斯汀甲醇液,每個濃度各制備5份作為對照品溶液,取20μL進(jìn)樣記錄色譜圖,得到對照溶液中來曲唑和內(nèi)標(biāo)的峰面積。另用空白血漿配制成來曲唑濃度為2.48、6.20、12.40、49.60μg/L和內(nèi)標(biāo)濃度為1.0μg/mL的血漿樣品各5份。按“1.4”項下處理,進(jìn)樣20μL記錄血漿樣品中來曲唑和內(nèi)標(biāo)的峰面積,以血漿樣品的峰面積除以同濃度的對照品峰面積所得的百分率計算萃取回收率。結(jié)果來曲唑4個濃度的萃取回收率分別為(90.55±12.26)%、(88.38±1.62)%、(88.82±8.65)%、(67.56±10.46)%(n=5);內(nèi)標(biāo)萃取回收率為(81.42±6.38)%(n=5)。

    2.4 方法回收率及精密度

    配制來曲唑濃度為2.48、6.20、12.40、49.60μg/L的血漿樣品各5份,按“1.4”項下處理后進(jìn)樣,記錄來曲唑和內(nèi)標(biāo)峰面積,按回歸方程計算測得濃度,分別在1天內(nèi)測定5次,以測得值與加入值的比值計算方法回收率和日內(nèi)精密度。上述3組樣品連續(xù)測定3d,計算日間精密度。結(jié)果方法回收率在87.88%~104.02%(n=20),日內(nèi)、日間RSD均<10%。

    2.5 樣品穩(wěn)定性試驗

    配制來曲唑濃度為6.20、12.40、49.60μg/L的血漿樣品,室溫下放置8h、復(fù)溶后室溫下放置12h、反復(fù)凍融2次或凍存20d,檢驗其穩(wěn)定性。結(jié)果在這4種情形下,來曲唑血漿樣品均處于穩(wěn)定狀態(tài)(RSD<8.6%)。

    2.6 方法學(xué)質(zhì)控

    配制來曲唑濃度為6.20、12.40、49.60μg/L的血漿樣品,即質(zhì)控樣品(QC樣品),按“1.4”項下操作,20μL進(jìn)樣。低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品均勻分布在未知樣品測試順序中。本試驗進(jìn)行了9次共27個QC樣品,結(jié)果QC樣品的測定值均落在靶值的87.7%~113.04%。

    2.7 血樣測定和藥物動力學(xué)參數(shù)

    18例受試者口服來曲唑受試制劑或參比制劑后的0~144h平均血藥濃度-時間曲線見圖2,受試試劑和參比制劑的主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表1。

    圖2 18例男性健康志愿者單劑量口服受試制劑(T)或參比制劑(R)2.5 mg后平均血藥濃度-時間曲線

    2.8 統(tǒng)計檢驗結(jié)果

    用梯形法(AUC0-t)估算受試制劑與參比制劑的相對生物利用度為(101.20±19.33)%。方差分析結(jié)果表明,二者主要藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-144和AUC0-∞在制劑間和周期間均沒有顯著性差異(P>0.05);Cmax、AUC0-144、AUC0-∞比值的90%置信區(qū)間分別為95.1%~103.3%、90.5%~108.4%、84.7%~112.1%;兩制劑的Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異(P>0.05),根據(jù)以上結(jié)果判定兩制劑生物等效。

    表1 18名健康受試者分別單劑量口服2.5mg來曲唑受試制劑或參比制劑后的藥物動力學(xué)參數(shù)(n=18,±SD)

    表1 18名健康受試者分別單劑量口服2.5mg來曲唑受試制劑或參比制劑后的藥物動力學(xué)參數(shù)(n=18,±SD)

    參數(shù) 來曲唑分散片(T) 來曲唑片(R)AUC0-144 [μg/(h·L)] 1662.65±300.94 1682.69±329.26 AUC0-∞ [μg/(h·L)] 2014.94±580.66 2063.84±571.17 Cmax (μg/L) 33.20±4.25 33.60±5.17 Tmax (h) 1.60±0.65 1.50±0.34 t1/2 (h) 70.61±21.21 66.82±18.26 F (%) 101.20±19.33

    3 討 論

    本文建立的測定來曲唑濃度的HPLC-UV法具有成本低、速度快、操作簡便、敏感度高及準(zhǔn)確性好等優(yōu)點。文獻(xiàn)采用C18柱液-固相萃取方法[9],回收率提高,但成本增加,洗脫時間長(大約20min);本文以乙醚為萃取劑,操作簡單、成本降低,萃取回收率高,保留時間僅為6.8min,耗時少。此方法的定量下限為2.48μg/L,方法回收率在87.88%~104.02%(n=20),日內(nèi)、日間RSD均<10%,符合體內(nèi)藥物分析及藥動學(xué)研究的要求。此外,本實驗首次采用咪唑斯汀為內(nèi)標(biāo),其色譜峰與來曲唑及內(nèi)源性物質(zhì)完全分離,保留時間為8min,穩(wěn)定性好,符合內(nèi)標(biāo)選擇的標(biāo)準(zhǔn)。

    兩種制劑的藥動學(xué)參數(shù)統(tǒng)計分析結(jié)果表明,來曲唑分散片的相對生物利用度為(101.20±19.33)%。兩制劑Cmax、AUC0-144和AUC0-∞沒有顯著性差異(P>0.05),其比值的90%置信區(qū)間均符合生物制劑等效標(biāo)準(zhǔn),Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗亦未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P>0.05),表明來曲唑分散片和來曲唑片具有生物等效性。

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