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    活血抗生滴丸對(duì)AA大鼠的抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用

    2010-11-07 08:28:48張文亮王淑美
    中國(guó)醫(yī)藥指南 2010年4期
    關(guān)鍵詞:佐劑滑膜踝關(guān)節(jié)

    張文亮 王淑美* 陳 剛

    大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant -induced arthritis,AA)屬免疫性炎癥模型,可表現(xiàn)為免疫功能紊亂、細(xì)胞因子失調(diào)及體內(nèi)相關(guān)激素水平異常等,其組織學(xué)特點(diǎn)包括滑膜增生,單核細(xì)胞浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)軟骨及骨組織破壞,與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)很近似[1]?;钛鲋兴幹委烺A有較好療效[2]。本試驗(yàn)探討了具有活血化瘀功效的活血抗生滴丸(Huoxuekangsheng Dripping Pills,HXKSDP)對(duì)AA模型大鼠炎癥發(fā)展和免疫功能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物

    清潔級(jí)Wistar大鼠50只,雄性,體質(zhì)量180~220g,由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXKa(渝)20020003。

    1.1.2 藥物

    HXKSDP由川芎、當(dāng)歸、延胡索等藥物組成。所有中藥飲片購(gòu)自重慶桐君閣大藥房,經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為正品。中藥飲片用乙醇滲漉法提取,工藝條件為12倍量,75%乙醇滲漉,滲漉速度為3mL/min,選用D101型大孔樹脂純化提取物,用1倍量的樹脂吸附,5倍量的60%乙醇洗脫,減壓濃縮成含生藥量10g/mL的浸膏,將浸膏加入溶化的PEG-4000,保持溫度98~100℃,滴制成滴丸,包薄膜衣。每克滴丸含阿魏酸不低于3mg。規(guī)格:每丸30mg。

    環(huán)孢素A(cyclosporine A,CsA)由四川抗菌素工業(yè)研究所提供,批號(hào):021102。

    1.1.3 試劑

    弗氏完全佐劑(FCA,1mg/mL高溫干燥滅活的結(jié)核桿菌),為Sigma公司產(chǎn)品。免疫球蛋白IgG、IgM、IgA 檢測(cè)用試劑(北京東亞免疫技術(shù)研究所),F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗鼠CD4+單抗、PE標(biāo)記的抗鼠CD8+單抗(晶美生物工程有限公司),流式細(xì)胞儀(FACS CALIBUR,美國(guó)BD公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 造模與分組

    無(wú)菌條件下于大鼠左后足掌皮下注射FCA 0.1mL。成模率100%。動(dòng)物免疫后第19天,Wistar大鼠隨機(jī)分為5組,即HXKSDP生藥含量0.63、1.25、2.5g/(kg?d)劑量組、陽(yáng)性對(duì)照CsA10mg/(kg?d)組及模型組給予生理鹽水2mL/d,每組10只,1次/d,連續(xù)灌胃30d。

    1.2.2 對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)炎癥的影響

    采用Volume meter測(cè)定大鼠雙側(cè)踝關(guān)節(jié)以下足容積之和,從開始灌胃給藥起,每10d量取,與造模前足容積之差值為腫脹度(mL)[3]。灌胃30d后取完整踝關(guān)節(jié)切片,HE染色后觀察大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的改變。

    1.2.3 對(duì)AA大鼠免疫功能的影響

    灌胃后第30天,股動(dòng)脈取血。處死動(dòng)物后,稱取各組動(dòng)物脾、胸腺重量,并計(jì)算其臟器指數(shù)[4]。器官指數(shù)=器官濕重/大鼠體質(zhì)量×100。免疫單擴(kuò)散法測(cè)定外周血中IgG、IgM、IgA含量。流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+及CD4+/ CD8+比值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)方法

    2 結(jié) 果

    2.1 HXKSDP對(duì)大鼠AA的抗炎作用

    治療20、30d后,HXKSDP高劑量組和CsA組足腫脹度降低,與模型組比較差異有顯著性(P<0.01),見表1。

    HE染色可見模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜增生,滑膜細(xì)胞數(shù)量增多,體積增大,排列為多層;滑膜下組織水腫、充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。HXKSDP高劑量組和CsA組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生明顯減少,炎性反應(yīng)減輕。

    2.2 HXKSDP對(duì)AA大鼠免疫功能的影響

    給藥30d后,HXKSDP高劑量組和CsA組AA大鼠的免疫器官脾和胸腺指數(shù)明顯降低,與模型組比較差異有顯著性(P<0.01),見表2。

    給藥30d后,HXKSDP高劑量組和CsA組能夠有效地降低血清中IgG 水平,減少CD4+細(xì)胞數(shù),升高CD8+細(xì)胞數(shù),降低CD4+/ CD8+比值(P<0.01)。結(jié)果提示HXKSDP對(duì)AA大鼠體液免疫及細(xì)胞免疫均有一定抑制作用,見表3和4。

    3 討 論

    大鼠AA模型是一種免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。炎癥以踝關(guān)節(jié)為重,可侵及足墊、全足,病理改變?yōu)榛は陆M織炎癥,滑膜增生,血管翳形成和軟骨破壞。Ts細(xì)胞功能和單核巨噬細(xì)胞異?;罨诎l(fā)病中占重要地位,從組織學(xué)而言,滑膜炎癥的發(fā)展是以巨噬細(xì)胞核CD4+T細(xì)胞占主要地位。且AA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)及血液中的變化與人類RA極其相似。

    RA是一種自身免疫性疾病,存在著體液免疫與細(xì)胞免疫功能的失調(diào)。體液免疫方面,B細(xì)胞功能亢進(jìn),致使免疫球蛋白分泌失控,大量分泌的免疫球蛋白與相應(yīng)抗原結(jié)合,存在于血液循環(huán)中或沉積于關(guān)節(jié)滑膜等處,致IgA、IgM,IgG升高。細(xì)胞免疫方面,CD4+升高,CD4+/ CD8+比值升高在RA的病理機(jī)制中起重要作用[4,5]。

    表1 HXKSDP對(duì)AA大鼠足腫脹度的影響(±s,n=10)

    表1 HXKSDP對(duì)AA大鼠足腫脹度的影響(±s,n=10)

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01

    腫脹度(mL)治療前 治療10d 治療20d 治療30d模型組 —— 1.80±0.26 1.77±0.23 1.74±0.31 1.76±0.29 CsA組 10mg/(kg?d)1.79±0.27 1.41±0.27* 1.13±0.22** 1.04±0.18**HXKSDP低劑量 0.63g/(kg?d)1.78±0.19 1.69±0.34 1.66±0.24 1.65±0.31 HXKSDP中劑量 1.25g/(kg?d)1.83±0.28 1.71±0.30 1.46±0.25* 1.39±0.28*HXKSDP高劑量 2.5g/(kg?d)1.82±0.21 1.44±0.31* 1.25±0.19** 1.11±0.23**

    表2 HXKSDP對(duì)AA大鼠免疫器官的影響(±s,n=10)

    表2 HXKSDP對(duì)AA大鼠免疫器官的影響(±s,n=10)

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01

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    表3 HXKSDP對(duì)AA大鼠體液免疫的影響(±s,n=10)

    表3 HXKSDP對(duì)AA大鼠體液免疫的影響(±s,n=10)

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01

    組 別 劑量 IgG IgA IgM模型組 —— 26.74±5.16 3.21±0.54 1.93±0.60 CsA組 10mg/(kg?d)13.56±3.68** 2.62±0.56* 1.69±0.49 HXKSDP低劑量 0.63g/(kg?d)22.31±4.76 3.24±0.59 1.90±0.35 HXKSDP中劑量 1.25g/(kg?d)18.13±3.75* 2.73±0.61 1.86±0.42 HXKSDP高劑量 2.5g/(kg?d)15.18±3.41** 2.77±0.60 1.89±0.59

    表4 HXKSDP對(duì)AA大鼠T淋巴細(xì)胞的影響(±s,n=10)

    表4 HXKSDP對(duì)AA大鼠T淋巴細(xì)胞的影響(±s,n=10)

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01

    組 別 劑量 CD4+(%)CD8+(%)CD4+ / CD8+模型組 —— 48.70±6.06 20.38±4.25 2.41±0.31 CsA組 10mg/(kg?d)38.56±5.23** 23.81±4.14** 1.65±0.26**HXKSDP低劑量 0.63g/(kg?d)47.25±5.33 20.78±4.84 2.28±0.40 HXKSDP中劑量 1.25g/(kg?d)45.74±6.20 22.23±2.58 2.04±0.31*HXKSDP高劑量 2.5g/(kg?d)42.33±4.52** 24.07±4.20** 1.73±0.21**

    RA屬于中醫(yī)“頑痹”、“骨痹”、“歷節(jié)病”、“白虎病”、“痹”等范疇,風(fēng)、寒、濕、熱等邪氣雜至襲于經(jīng)絡(luò)、痹于關(guān)節(jié),使氣血運(yùn)行不暢,晚期引起關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形?!峨s病源流犀濁?諸痹源流》謂:“痹者,閉也,三氣雜至,壅痹經(jīng)絡(luò),血?dú)獠恍校荒茈S時(shí)祛散,故久為痹”。可見RA 與“血瘀”關(guān)系密切。RA存在微循環(huán)障礙和血液流變學(xué)異常,并有隨著病程的延長(zhǎng)而有逐漸加重的傾向?!把觥痹赗A中的重要性決定了活血化瘀是RA的一個(gè)基本治則。葉天士提出痹久不愈,邪入于絡(luò),用活血化瘀法治療。臨床上活血化瘀方藥如桃紅飲、桃紅四物湯、血府逐瘀湯、復(fù)方丹參注射液等在RA的治療中已廣泛應(yīng)用并顯示出確切的療效。本實(shí)驗(yàn)研究的HXKSDP由川芎、當(dāng)歸、延胡索等中藥提取精制組成。其中川芎為血中之氣藥,兼有祛風(fēng)通絡(luò)之功;當(dāng)歸養(yǎng)血活血,使祛瘀而不傷正;延胡索活血行氣止痛。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HXKSDP能明顯減輕AA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹,減輕炎癥關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞,降低免疫器官脾指數(shù)、胸腺指數(shù),能明顯降低IgG含量,減少CD4+細(xì)胞數(shù),升高CD8+細(xì)胞數(shù),降低CD4+/ CD8+的比值??梢娫撍帉?duì)AA大鼠具有明顯的抗炎和免疫抑制作用,這可能也是活血化瘀中藥治療RA的機(jī)制之一。

    [1]Hoffmann M,Hayer S,Steiner G. Immmunopathogenesis of rheumatoid arthritis; induction of arthritogenic autoimmune responses by proin fl ammatory stimuli[J]. Ann NY Acad Sci,2009,1173:391-400.

    [2]王少紅,潘竟鏘,肖柳英,等.小活絡(luò)丸抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫性炎癥作用機(jī)制[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志,2009,18(16):6-7.

    [3]袁鳳來(lái),陳飛虎,陸偉國(guó),等.酸敏感離子通道阻斷劑amiloride對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2009,25(7):895-900.

    [4]蔡輝,鄭召嶺,商瑋,等.姜黃素對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜病理和免疫器官質(zhì)量的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2009,18(4): 594-595.

    [5]王勇,章敏,金偉偉,等.熱痹顆粒對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞凋亡及T細(xì)胞亞群的影響[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2009,38(5):105-107.

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