大川芎方中藁本內(nèi)酯及天麻素在家兔血漿中的代謝物研究

倪書茂， 錢大瑋*， 段金廒*， 郭建明， 王振中， 尚爾鑫， 孫國玲

(1.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省方劑研究重點實驗室，南京210046;2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港222001)

大川芎方源于金·劉完素《宣明論方》卷二，川芎和天麻配伍組成為4∶1，具有活血化瘀、息風止痛的功效，主治首風眩暈，及胃膈痰飲，偏頭痛，身體拘倦。通過內(nèi)外兼治，治療瘀血阻滯、風熱上擾所致的頭痛諸證［1］。藁本內(nèi)酯、天麻素是該方的主要有效成分，是治療偏頭痛的主要效應組分［2，3］。有關藁本內(nèi)酯、天麻素及大川芎方的藥代動力學、藥理作用研究較多，但對大川芎方提取物給藥后主要有效成分藁本內(nèi)酯及天麻素在體內(nèi)代謝物研究的報道尚未見。為了探討大川芎方給藥后藁本內(nèi)酯及天麻素在體內(nèi)的代謝物及其代謝途徑，本文采用 UPLCQTOF/MS聯(lián)用技術，將 MSE數(shù)據(jù)采集模式與MetaboLynxTM軟件的質量虧損過濾(DMF)技術結合，對家兔灌胃大川芎方提取物后在血漿中藁本內(nèi)酯及天麻素的代謝物進行分析鑒定，為大川芎方藥效物質基礎研究提供依據(jù)。

1 儀器和動物及試藥

儀器 AcquityTMUPLC系統(tǒng)(Waters公司);SynaptTMQ-TOF質譜儀(Waters公司)，配有Lock-spray接口;電噴霧離子源(ESI);MassLynx 4.1質譜工作站(Waters公司)，MetaboLynxTM軟件(Waters公司);DZ 30-32高速離心機(上海安亭科學儀器廠);WH-1微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)，電子天平(BT125，賽多利斯科學儀器有限公司)，EPED超純水系統(tǒng)(南京易普達易科技發(fā)展有限公司)。

動物 新西蘭家兔，體重1.8～2.0 kg，♀♂各半，由南京江寧縣湯山青龍山動物繁殖場提供，實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2007-0008。

試藥 川芎產(chǎn)于四川，天麻產(chǎn)于安徽，均由南京中醫(yī)藥大學段金廒教授鑒定，分別為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖和蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖。天麻素對照品(110807-200205，中國藥品生物制品檢定所)、藁本內(nèi)酯與正丁烯基苯酞(自制，HPLC歸一化法分析純度達98%)。乙腈(HPLC級，TEDIA公司)，其他試劑為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

2 試驗方法

2.1 儀器條件

色譜分析條件 Waters AcquityTMUPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，1.7μm);柱溫30 ℃;流速0.4 mL/min;進樣量5μL;流動相:乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫:0～15 min:3% ～95%A，15～25 min:95% ～95%A。

質譜檢測條件 ESI源，掃描方式:ESI+模式，毛細管電壓:1.5 kV，錐孔電壓:40 V，離子源溫度:100℃，脫溶劑氣溫度:250℃，錐孔氣流量:50 L/h，脫溶劑氣流量:60 L/h，碰撞能量(6～40 V)，離子能量:1 V，每0.1 s采集2次圖譜;準確質量測定采用亮 氨 酸-腦 啡 肽 (Leucine-enkephalin，ESI+:m/z 556.277 1)溶液為鎖定質量溶液。質量掃描范圍:80～1 000 m/z，數(shù)據(jù)采集模式和方式:MSE和Centroid，數(shù)據(jù)分析:MetaboLynxTM軟件。

2.2 樣品處理

2.2.1 對照品溶液配制 分別精密稱取Z-藁本內(nèi)酯、正丁烯基苯酞、天麻素適量，用70%乙腈溶解配制成濃度分別為42.2、40.7、36.0μg/mL的對照品溶液，用于UPLC-QTOF/MS分析。另量取Z-藁本內(nèi)酯適量，用食用油溶解，得0.1 g/mL灌胃溶液。

2.2.2 大川芎方樣品制備 取川芎1 000 g，加10倍量水，浸泡3 h，加熱回流提取揮發(fā)油3 h，濾液減壓濃縮至相當于1 g生藥，再加乙醇使含醇量為70%，醇沉，靜置 24 h，離心(3 000 r/min，10 min)，上清液減壓濃縮至無醇味呈稠膏狀，得浸膏Ⅰ。取250 g天麻加入上述川芎藥渣中，加10倍量70%乙醇，加熱回流提取2次，每次2 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無醇味呈稠膏狀，得浸膏Ⅱ。將浸膏Ⅰ、浸膏Ⅱ及揮發(fā)油混合均勻，得大川芎方提取物(每克浸膏相當于3.7 g生藥量)。

2.2.3 家兔代謝樣品處理 取家兔6只，分為空白組、Z-藁本內(nèi)酯組和大川芎方組，按人臨床用藥量20倍給家兔灌胃，Z-藁本內(nèi)酯組0.2 g/kg體重，大川芎方組11.667 g生藥/kg體重，空白組給予等量蒸餾水，連續(xù)3 d，每天一次，末次給藥前12 h禁食，不禁水，末次給藥1 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，置肝素試管中，充分混勻，以3 000 r/min離心10 min后取上清液，合并各組血漿。取5 mL血漿加3倍量乙腈，渦旋均勻，13 000 r/min(4℃)離心10 min，取上清液;氮氣流吹干，用100μL流動相復溶，13 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用于UPLC-QTOF/MS分析。

2.3 MetaboLynxTM數(shù)據(jù)處理的程序設置

將大川芎方中藁本內(nèi)酯及天麻素Ⅰ相、Ⅱ相代謝途徑可能產(chǎn)生的代謝物輸入MetabolynxTM軟件見表1，選用ApexTrack峰整合算法，代謝產(chǎn)物峰面積:>1 pau，質譜數(shù)據(jù)檢測誤差范圍:<5 mDa，并將質量虧損過濾(DMF)應用于空白血漿與含藥血漿UPLC-QTOF/MS數(shù)據(jù)的處理。

表1 Ⅰ相及Ⅱ相可能產(chǎn)生的代謝途徑

3 結果與討論

3.1 UPLC-QTOF/MS分析及數(shù)據(jù)處理

利用UPLC-QTOF/MS及MSE數(shù)據(jù)采集技術對空白血漿和給藥血漿進行測定，得出ESI+總離子流圖見圖1，在ESI+下，大川芎方給藥血漿未得到較好的響應信號。通過MetabolynxTM軟件的質量虧損過濾器(MDF)技術處理數(shù)據(jù)，得到大川芎方提取物中藁本內(nèi)酯及天麻素的代謝物見圖2，各代謝物的生物轉化途徑見表2。

3.2 代謝物結構鑒定

代謝物鑒定的主要依據(jù)是藥物發(fā)生代謝轉化后，一般是在原藥的基礎上進行部分結構修飾，藥物的母體結構一般不會發(fā)生太大變化，因此代謝物與原藥常有相似的質譜特征離子，據(jù)此可對代謝物進行識別，再結合其它碎片離子的信息和藥物的生物體內(nèi)代謝規(guī)律，對代謝物做出合理推斷。

圖1 UPLC-ESI+-QTOF/MS的總離子流圖

表2 大川芎方中藁本內(nèi)酯及天麻素代謝物的生物轉化

圖2 大川芎方中藁本內(nèi)酯及天麻素的代謝物經(jīng)DMF處理后的色譜圖

3.2.1 原型藥物的識別與鑒定 M01(TR9.58 min)與M02(TR9.94 min)

由MetabolynxTM軟件處理，給藥血漿ESI+圖中，檢測到m/z為191［M+H］+但保留時間分別為9.58 min與9.94 min的2個質譜峰，川芎中存在分子量為190的藁本內(nèi)酯2個異構體。將給藥血漿與Z-藁本內(nèi)酯對照品離子流圖比較，TR為9.94 min處皆有 m/z 191 峰，MSE圖中皆有 m/z 191、173、163、145、129、115峰，據(jù)此推測，血漿中 TR為 9.94 min的峰為Z-藁本內(nèi)酯，TR為9.58 min為E-藁本內(nèi)酯，這與文獻［4-6］報道的使用C18反相色譜柱時，E-藁本內(nèi)酯出峰較Z-藁本內(nèi)酯出峰早的結果相一致。

在給藥血漿ESI+圖中未檢測到天麻素原型m/z287［M+H］+的相應信號，與文獻［7］報道相符。

3.2.2 代謝物的識別與鑒定

3.2.2.1 氧化反應產(chǎn)物的鑒定

藥物代謝中的氧化反應包括氧化反應和脫氫反應等，主要是在CYP-450酶系催化下進行的反應。在CYP-450酶系作用下，長碳鏈的烷烴常在碳鏈末端甲基上氧化生成羥基，環(huán)二烯己烷易芳香化脫氫生成穩(wěn)定的苯環(huán)結構。同時也容易發(fā)生去羥甲基化及甲基化反應。

M1(TR7.40 min)與M2(TR7.80 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中7.40 min與7.80 min處存在m/z 207峰的兩個化合物，一級MS顯示m/z 207［M+H］+為其分子離子峰，對 m/z 207［M+H］+進行 MSE分析，顯示189［M+H-H2O］+、161［M+H-H2O-CO］+、121［M+H-H2O-CO-C3H4］+、119［M+H-H2O-COC3H6］+的主要碎片離子峰，推測其為互為順反異構藁本內(nèi)酯羥基化氧化反應的代謝產(chǎn)物，通過與Z-藁本內(nèi)酯組比較并結合文獻［8］分析，推斷TR7.40 min的代謝物M1為E-11-羥基藁本內(nèi)酯，TR7.80 min的代謝物M2為Z-11-羥基藁本內(nèi)酯。

M5(TR9.32 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖一級MS中，9.32 min處存在m/z 189［M+H］+的分子離子峰，對 m/z 189［M+H］+進行 MSE分析，顯示161［M+H-28］+、143的主要碎片 m/z分別比藁本內(nèi)酯的相應碎片少2，與正丁烯基苯酞對照品比較，其色譜及質譜行為相一致。Z-藁本內(nèi)酯給藥組圖譜中存在相同的碎片峰，推測TR9.32 min的代謝物M5為藁本內(nèi)酯脫氫化產(chǎn)物，即芳構化轉變成正丁烯基苯酞，并與文獻［8］的結果相符。

M7(TR5.56 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中5.56 min處存在m/z257峰的化合物，一級MS顯示m/z257［M+H］+為其分子離子峰，對m/z257［M+H］+進行 MSE分析，顯示 95［M+H-162］+的主要碎片離子峰，推測TR5.56 min的代謝物M7為天麻素去羥甲基化反應的代謝產(chǎn)物。

M8(TR5.41 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中5.41 min處存在m/z273峰的化合物，一級MS顯示m/z273［M+H］+為其分子離子峰，對m/z273［M+H］+進行 MSE分析，顯示111［M+H-162］+的主要碎片離子峰，推測TR5.41 min的代謝物M8為天麻素去甲基化反應的代謝產(chǎn)物。

3.2.2.2 水解反應產(chǎn)物的鑒定

水解反應是具有酯類藥物在體內(nèi)代謝的主要途徑，在酯酶的催化作用下，代謝生成酸。M3(TR7.11 min)與M4(TR9.58 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中7.11 min與9.58 min處存在m/z 209峰的兩個化合物，一級MS顯示m/z 209［M+H］+為其分子離子峰，對 m/z 209［M+H］+進行 MSE分析，顯示191［M+H-H2O］+、173、163、145 的主要碎片離子峰，與藁本內(nèi)酯對照品的裂解方式相吻合，推測M3、M4為互為順反異構藁本內(nèi)酯水解反應的代謝產(chǎn)物，但在Z-藁本內(nèi)酯組未檢測到這兩個化合物。

3.2.2.3 氨基酸結合產(chǎn)物的鑒定

氨基酸結合反應是體內(nèi)許多羧酸類藥物和代謝物的主要結合反應，其中包含有S-半胱氨酸和甘氨酸，是在輔酶A的催化作用下進行反應。

M6(TR6.48 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖一級MS中，6.48 min處存在分子離子峰m/z 310［M+H］+的化合物，比原型藥物多119個質量單位，對m/z 310［M+H］+進行 MSE分析，顯示191［M+H-119］+、175、145 等與藁本內(nèi)酯相同的主要碎片離子峰，并通過Z-藁本內(nèi)酯組圖譜比較分析，推測TR6.48 min的代謝物M6為Z-藁本內(nèi)酯S-半胱氨酸結合反應的代謝產(chǎn)物。

M9(TR6.34 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中6.34 min處存在m/z344峰的化合物，一級MS顯示m/z344［M+H］+為其分子離子峰，對m/z344［M+H］+進行 MSE分析，顯示 287［M+H-57］+、125的主要碎片離子峰，推測TR6.34 min的代謝物M9為天麻素甘氨基酸結合反應的代謝產(chǎn)物。

3.2.2.4 乙?；磻a(chǎn)物的鑒定

乙?；磻窃邗；D移酶的催化下進行的，以乙酰輔酶A作為輔酶，對羥基進行乙?；磻?。M10(TR7.80 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中7.80 min處存在m/z329峰的化合物，一級MS顯示m/z329［M+H］+為其分子離子峰，對m/z329［M+H］+進行 MSE分析，顯示 287［M+H-42］+、125的主要碎片離子峰，推測M10為天麻素乙?；磻拇x產(chǎn)物。

3.3 討論

液質聯(lián)用(LC-MS/MS)技術具有靈敏度高和分析復雜混合物的能力，獲得被測物的分子結構信息，從而能夠在沒有對照品的情況下對未知物進行定性分析，該方法已成為藥物代謝鑒定的特別技術［9］。運用該技術不僅可以避免復雜繁瑣的分離純化代謝物的工作，而且可以分離鑒定難以辨識的體內(nèi)痕量代謝物。本文使用UPLC-QTOF聯(lián)用技術，采用MSE操作模式，該模式能迅速地在兩種MS能量間切換，首先獲得低能量譜圖，然后應用階梯碰撞能獲取譜圖，應用ApexTrack峰整合算法分析所有復雜樣品信息，包括所有準分子離子和子離子，只需進樣一次，所得的數(shù)據(jù)應用質量虧損過濾技術進行代謝產(chǎn)物的篩選和鑒定。質量虧損過濾是一種比較新的數(shù)據(jù)處理技術，利用母體藥物的精確質量數(shù)和它接近的整數(shù)值之間的差異，估計這些代謝物的分子量范圍和質量虧損落在什么區(qū)間，去除落在期望的范圍之外的所有離子，縮小假陽性的數(shù)目，提高更可信的結果［10］。

中藥復方是中醫(yī)治病的主要臨床應用形式，是由多味中藥組成，而各味中藥又由多種成分組成，研究顯示許多中藥復方的配伍變化會直接導致體內(nèi)代謝途徑和代謝產(chǎn)物的變化［11］，故某一成分的代謝只是整味中藥或復方代謝全貌的極小部分，而復方代謝的全貌不僅是各成分代謝或各味中藥代謝的簡單疊加和綜合。本研究中，大川芎方給藥組中存在藁本內(nèi)酯水解反應的代謝產(chǎn)物，而在Z-藁本內(nèi)酯給藥組中未檢測到相應的信號，這可能與復方中藥效物質相互作用有關。

本研究應用MSE與質量虧損過濾技術鑒定了大川芎方在家兔血漿中藁本內(nèi)酯及天麻素兩個主要有效成分的代謝物，藁本內(nèi)酯被檢測到原型及其氧化、水解反應的5個Ⅰ相代謝產(chǎn)物和1個半胱氨酸軛合Ⅱ相代謝產(chǎn)物;天麻素原型藥物未出現(xiàn)，共檢測到氧化與軛合反應等4個代謝產(chǎn)物，為大川芎方藥效物質基礎和作用機理提供依據(jù)，并有助于大川芎方的合理臨床用藥方案和質量控制提供一定的參考。

［1］彭懷仁.中華名醫(yī)方劑大全［M］.金盾出版社，1990:53.

［2］Guo Jianming，Duan Jin-ao，Shang Er-xin，et al.Determination of ligustide in rat brain after nasal administration of essential oil from Rhizom Chuanxiong［J］.Fitoterapia，2009，80:168-172.

［3］劉慧蘭，曹克剛，高永紅，等.天麻素預防大鼠偏頭痛發(fā)作的功效評價及其作用機制研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，2(15):32-33.

［4］Lin L Z，He X G，Lian L Z，et al.Liquid chromatographic-electrospray mass spectrometric study of phthalides of Angelic sinensis and chemical changes of Z-ligustide［J］.J Chromatogr A，1998，810:71-79.

［5］Lu G H，Kelvin C，Liang Y Z，et al.Development of high-performance liquid chromatographic fingerprinrs for distinguishing Chinese Angelia form related Umbelliferae herbs［J］.J Chromatogr A，2005，1073:383-392.

［6］Lao SC，Li SP，Kelvin K，et al.Identification and quantification of 13 components in Agelica sinensis(danggui)by gas chtomatography mass spectrometry coupled with pressurized liquid extraction［J］.Anatl Chim Acta，2004，526:131-137.

［7］楊秀偉主編.中藥成分的吸收、分布、代謝、排泄、毒性與藥效［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2006:8.

［8］Ru Y，Nga Ling Ko，Li SL，et al.Pharmacokinetics and metabolism of ligustilide，a major bioactive component in Rhizoma Chuanxiong，in the rat［J］.Drug Metabo Diposit，2008，36:400-408.

［9］馮年平，狄 斌，劉文英.藥物代謝研究與中藥現(xiàn)代化［J］.世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2003，5(2):5.

［10］Zhu M S，Ma L，Zhang D L，et al.Detection and characterization of metabolites in biological matrices using mass defect filtering of liquid chromatography/high resolution mass spectrometry data［J］.Drug Metabo Diposit，2006，34:1722-1733.

［11］王 巧，劉 榮，霞果德，等.中藥代謝研究的現(xiàn)狀與展望［J］. 世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2003，6(5):30-36.