α-酪蛋白水解產(chǎn)物對高血壓大鼠血壓的影響

張 艷，胡志和*

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

α-酪蛋白水解產(chǎn)物對高血壓大鼠血壓的影響

張 艷，胡志和*

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

研究水解α-酪蛋白所得水解產(chǎn)物對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血壓的影響。用α-酪蛋白水解產(chǎn)物以低、中、高3個劑量(0.0245、0.1225、0.6125g/kg bw)分別灌胃SHR大鼠，0.6125g/kg bw灌胃正常Wistar大鼠，測定灌胃后1～8h尾動脈收縮壓(SBP)。結(jié)果顯示，單次灌胃8h內(nèi)，高劑量α-酪蛋白水解產(chǎn)物對正常Wistar大鼠的血壓無影響；3種劑量對SHR的血壓升高有明顯抑制作用，且高劑量組在0～6h內(nèi)降壓效果最佳，SBP維持在較低水平的時間最長，達到6h，SBP值下降了(29.50±1.0)mmHg。連續(xù)灌胃高劑量α-酪蛋白水解產(chǎn)物可較長時間維持低水平SBP。

α-酪蛋白水解產(chǎn)物；原發(fā)性高血壓大鼠；收縮壓

隨著人們生活水平的提高，被人們俗稱“三高”之一的高血壓的發(fā)病率也逐年遞增，人們在吃藥控制病情的同時，也承受著藥物帶來的一系列副作用。因此，更多人開始關(guān)注具有同樣抗高血壓效果又無毒、無副作用的食品源ACE抑制肽[1-2]。

牛乳中含有多種生物活性肽，如抗高血壓肽、阿片活性肽、免疫調(diào)節(jié)肽等[3-4]，較多存在于αs1-、β-、κ-酪蛋白的水解物中[5]。已鑒定出αs2-酪蛋白中含有抗菌肽和ACE抑制肽，源于αs2-酪蛋白微生物 Lactobacillus helveticus CP790作用所產(chǎn)生的多個短肽段在體外具有微弱的ACE抑制性，而在體內(nèi)則沒有顯著活性[6]。而用As.1398中性蛋白酶制備的酪蛋白水解物在原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)中卻表現(xiàn)出抗高血壓作用[7]。目前，國內(nèi)外對于模擬胃腸道環(huán)境對α-酪蛋白進行酶解，測定其產(chǎn)物體內(nèi)ACE抑制活性的報道較少。本研究以胃蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶水解α-酪蛋白所得水解產(chǎn)物為受試樣品，對SHR進行灌胃，研究其在SHR體內(nèi)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛乳α-酪蛋白水解產(chǎn)物(IC50值為17.24μg/mL)由天津食品生物技術(shù)重點實驗室制備。

原發(fā)性高血壓模型大鼠(SHR)和Wistar大鼠購自中國醫(yī)學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究所。12周齡雄性SHR，32只，體質(zhì)量(260±15)g，收縮壓＞200mmHg。飼養(yǎng)條件：自由采食飲水，保持環(huán)境溫度(23±1)℃，相對濕度(60±5)%。

BP-2006A型智能無創(chuàng)血壓計 北京軟隆科技有限責(zé)任公司；FA1104N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 α-酪蛋白水解產(chǎn)物的制備

α-酪蛋白采用復(fù)合酶進行酶解，先用胃蛋白酶酶解(酶解條件：40℃、pH3.1、酶與底物比1:250、底物質(zhì)量濃度7g/100mL)，再用胰蛋白酶進行酶解(酶解條件：48℃、pH8.5、酶與底物比1:1500、底物質(zhì)量濃度7g/100mL)。酶解結(jié)束后，沸水浴15min，滅酶，冷卻，然后調(diào)節(jié)pH值至中性，離心取上清液，進行真空冷凍干燥，即得α-酪蛋白水解產(chǎn)物，備用。

1.2.2 實驗動物分組

SHR和Wistar大鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后分組。SHR大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為空白組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。分別灌胃生理鹽水1mL/100g bw和牛乳α-酪蛋白源水解產(chǎn)物0.0245、0.1225、0.6125g/ kg bw。另取正常Wistar 大鼠10只，分為2組，分別作為空白組和劑量組，灌胃生理鹽水和牛乳α-酪蛋白水解產(chǎn)物0.6125g/kg bw。

1.2.3 原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血壓測定

采用BP-2006A型智能無創(chuàng)血壓計，測定采用SHR尾動脈收縮壓。測定前，將大鼠固定于鼠網(wǎng)保溫套中在39℃下恒溫預(yù)熱。大鼠每天灌胃1次，測定灌胃后1～8h的尾動脈血壓，連續(xù)測3次，對測得的SHR大鼠收縮壓進行讀數(shù)，取平均值，實驗數(shù)據(jù)以“x±s”表示。

1.2.4 單次灌胃實驗

按照上述劑量對相應(yīng)組進行灌胃，每天1次，測定灌胃后1～8h的尾動脈血壓，連續(xù)測3次，觀察灌胃后大鼠的收縮壓(SBP)的變化。

1.2.5 連續(xù)灌胃實驗

以高劑量牛乳α-酪蛋白水解產(chǎn)物灌胃SHR大鼠，每隔4h灌胃1次，每天兩次，測定灌胃后2h的SBP值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 11.5軟件分析實驗結(jié)果，比較各組與正常對照組之間差異的顯著性，所得結(jié)果應(yīng)用配對t檢驗，P＜0.05或P＜0.01表明統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌胃α-酪蛋白水解產(chǎn)物對正常Wistar大鼠的影響

以牛乳α-酪蛋白水解產(chǎn)物0.6125g/kg bw灌胃正常Wistar大鼠，由圖1可知，在0～8h范圍內(nèi)，其收縮壓差異不顯著(P＞0.05)，表明α-酪蛋白水解產(chǎn)物對正常大鼠不起降壓作用。

圖1 α-酪蛋白水解產(chǎn)物對正常Wistar大鼠血壓的影響Fig. 1 Antihypertensive effect of theα-casein hydrolysate on the SBP of normal Wistar rats

2.2 單次灌胃α-酪蛋白水解產(chǎn)物對SHR大鼠的影響

圖2 單次灌胃α-酪蛋白水解產(chǎn)物對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.2 Antihypertensive effect of single administration of theα-casein hydrolysate on the SBP of SHRs

單次灌胃α-酪蛋白水解產(chǎn)物后1～8h SHR大鼠的SBP變化見圖2。所有劑量組SHR大鼠的血壓均與空白組相比較有明顯下降，且血壓下降幅度隨灌胃劑量的增大而增大。統(tǒng)計顯示在8h內(nèi)各劑量組與空白組比較有顯著性差異(P＜0.01)。血壓變化灌胃1h后所有劑量組的血壓都有明顯下降，隨時間延長，低、中劑量組在3h時達到最低值，分別下降了(13.00±2.86)mmHg和(19.00±3.35)mmHg，而高劑量組則在5h才達到最低值，降幅為(29.50±1.05)mmHg，然后血壓開始慢慢回升。低、中劑量組在8h 基本恢復(fù)到灌胃前的水平，而高劑量組則可較長時間的維持較低的血壓水平，在8h 時血壓水平仍處于較低的水平，這表明高劑量組的α-酪蛋白水解產(chǎn)物有較強的抗高血壓的效果。

2.3 連續(xù)灌胃α-酪蛋白水解產(chǎn)物對SHR大鼠的影響

連續(xù)灌胃α-酪蛋白水解產(chǎn)物后SHR大鼠的SBP變化見圖3。降壓肽效果如何，除了考察其是否能有顯著的降壓作用，還有一個重要的方面就是考察其降壓的穩(wěn)定性，因此在單次灌胃實驗的基礎(chǔ)上，用高劑量的水解產(chǎn)物進行連續(xù)灌胃實驗，考察α-酪蛋白水解產(chǎn)物降壓的穩(wěn)定性。同時選取較有代表性的測量圖，圖4為用BP98AWU軟件測定的灌胃前的其中一個血壓值。由圖3可知在灌胃2h后血壓有顯著降低，降幅達到(30.55± 1.25)mmHg，在灌胃4h前測定血壓降低了(34.21±2.05) mmHg，圖5為灌胃4h后測定的其中一個有代表的血壓值。然后進行第2次灌胃，在兩次灌胃后2h和4h，即6h和8h時血壓仍處于較低的水平，分別比初始血壓值降低(33.60±1.55)mmHg和(33.10±1.45)mmHg。各測定點與初始點相比較有顯著性的差異(P＜0.01)，平均降幅達到(32.87±0.80)mmHg。這表明每隔4h灌胃1次，可長時間的維持較低水平的血壓值，α-酪蛋白水解產(chǎn)物具有很好的穩(wěn)定性，這為其轉(zhuǎn)化成抗高血壓功能性食品提供了有力的數(shù)據(jù)理論支持。

圖3 連續(xù)灌胃α-酪蛋白水解產(chǎn)物對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.3 Antihypertensive effect of continuous administration of the α-casein hydrolysate on the SBP of SHRs

圖4 初始血壓測量圖Fig.4 Blood pressure measurement before administation

圖5 灌胃4h測量的血壓圖Fig.5 Blood pressure measurement 4 hours after administration

3 討 論

本實驗選取α-酪蛋白作為原料，以胃蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶模擬體內(nèi)胃腸道環(huán)境對其進行水解，對酶解所得水解產(chǎn)物的抗高血壓效果進行驗證。實驗研究結(jié)果表明，α-酪蛋白水解產(chǎn)物對SHR大鼠的血壓升高具有明顯的抑制作用，而對于正常的Wistar大鼠無降低血壓作用，這表明所得水解產(chǎn)物對于正常血壓不會有影響，其作用是有針對性的。姜瞻梅等[7]用牛乳酪蛋白酶解物對SHR和Wistar大鼠進行灌胃實驗，酶解物對于Wistar大鼠血壓無影響，與本實驗結(jié)果相一致。

許多研究表明α-酪蛋白酶解物具有抗高血壓的作用。Tauzin等[5]用胰蛋白酶酶解αs2-酪蛋白獲得αs2-CN (f174～181)和αs2-CN (f174～179)兩個肽段，測定其IC50值為4μmol/L，表明其具有較高的ACE抑制作用；del Mar Contreras等[8]用胃蛋白酶酶解酪蛋白獲得水解產(chǎn)物，并進行鑒定，其中αs1-CN(f90～94，RYLGY)，αs1-CN (f143～149，AYFYPEL)和αs2-CN(f89～95，YQKFPQY) 3個肽段的IC50值分別為0.71、6.58 、20.08μmol/L，以5mg/kg bw的劑量對SHR進行灌胃，肽段RYLGY和AYFYPEL都顯示出與三肽VPP相似的顯著降壓效果；宮霞等[9]用經(jīng)大孔樹脂DA201C脫鹽處理的酪蛋白酶解物以500mg/kg bw和1000mg/kg bw進行灌胃，結(jié)果顯示低劑量組對SHR有顯著的降血壓作用，高劑量組則非常顯著。姜瞻梅等[7]研究表明As.1398中性蛋白酶制備的酪蛋白水解物在SHR中表現(xiàn)出抗高血壓作用，單次灌胃可使其血壓下降23mmHg左右(P＜0.01)。本實驗中α-酪蛋白水解產(chǎn)物3個劑量組對于SHR都具有顯著的抗高血壓作用。其作用效果隨著劑量的增大而增強，高劑量組的作用最顯著，最大降幅為(29.50±1.05)mmHg (P＜0.01)，維持較低血壓的時間也最長，長達5h，與上述研究報道較為一致。

而α-酪蛋白水解產(chǎn)物體外檢測IC50值為17.24μg/mL，與del Mar Contreras[8]研究中胃蛋白酶酶解酪蛋白所得ACE抑制肽的IC50值(22.19±1.6)μg/mL相比較也是較低的，IC50值越低樣品的抗高血壓效果也就越好，因此在體外檢測中本實驗所得水解產(chǎn)物含有ACE抑制肽成分，此水解產(chǎn)物同樣具有很好的抗高血壓作用。綜合上述兩方面，可得出α-酪蛋白水解產(chǎn)物的體內(nèi)、體外都具有抗高血壓效果，且效果一致較好。這為將α-酪蛋白水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成功能性的抗高血壓食品提供參考。

到目前為止，多種生物活性肽已經(jīng)被證明在調(diào)節(jié)胃腸道、神經(jīng)、心血管和免疫系統(tǒng)功能方面具有顯著作用[10]。而本實驗結(jié)果表明α-酪蛋白水解產(chǎn)物片段除具有抗血壓升高作用外，在灌胃受試樣品時SHR大鼠還出現(xiàn)了糞便濕潤度增加及排便順暢的現(xiàn)象，因此α-酪蛋白水解產(chǎn)物對SHR胃腸道的作用有待于進一步研究。

[1]van ZWIETEN P A, 黎群. 藥物治療原發(fā)性高血壓的益處與危險因素[J]. 藥物流行病學(xué)雜志, 1998, 7(1): 11-16.

[2]楊青, 劉樺. 抗高血壓藥物的選擇與評價[J]. 臨床藥物治療雜志, 2008, 6(5): 24-29.

[3]SILVA S V, MALCATA F X. Caseins as source of bioactive peptides[J]. International Dairy Journal, 2005, 15(1): 1-15.

[4]田瑋, 劉鳳美, 王振閣. 乳源生物活性肽類研究進展[J]. 河南畜牧獸醫(yī), 2003, 24(6): 10-12.

[5]TAUZIN J, MICLO L, GAILLARD J L. Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from tryptic hydrolysate of bovine αS2-casein [J]. FEBS Letters, 2002, 531(2): 369-374.

[6]MAENO M, YAMAMOTO N, TAKANO T. Identification of an antihypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790[J]. Journal of Dairy Science, 1996, 79 (8): 1316-1321.

[7]姜瞻梅, 高松濤, 田波, 等. 牛乳酪蛋白酶解物對SHR大鼠血壓影響的試驗研究[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2007, 29(3): 280-283.

[8]del Mar CONTRERAS M, CARRON R, MONTERO M J, et al. Novel casein-derived peptides with antihypertensive activity[J]. International Dairy Journal, 2009, 19(10): 566-573.

[9]宮霞, 郝桂玉, 王蘭芳, 等. 酪蛋白酶解產(chǎn)物對高血壓影響的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報, 2007, 29(5): 476-479.

[10]MIGUEL M, CONTRERAS M M, RECIO I, et al. ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2009, 112(1): 211-214.

Effect of α-Casein Hydrolysate on Blood Pressure in Spontaneously Hypertensive Rats

ZHANG Yan，HU Zhi-he*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Different doses (low dose, 0.0245 g/kg bw; medium dose, 0.1225 g/kg bw; and high dose, 0.6125 g/kg bw) of an αcasein hydrolysate prepared by sequential enzymatic hydrolysis with pepsin followed by trypsin were orally administered to spontaneously hypertensive rats (SHRs), and the SHRs were tested for their systolic blood pressure (SBP) during 8 hours postadministration once a day for continuously 3 days in order to the anti-hypertension effect of single administration of theα-casein hydrolysate in SHRs. Moreover, in the continuous administration trial, high-dose administration was performed once at the time intervals of four hours twice a day and SBP measurement was done 2 hours after each administration. The results showed that in the single administration trial, normal Wistar rats administered high dose of theα-casein hydrolysate did not present any obvious change in SBP within 8 hours after administration. Each of the three doses had a notable inhibitory effect on the increase of SBP in SHRs. Among them, the antihypertensive effect of high dose was the best within the first 6 hours, and the SBP level of SHRs administered high dose for the longest period of time, reaching up to 6 hours, and the largest decrease by (29.50 ± 1.0) mmHg was observed at 5 hours. Furthermore, continuous administration of high dose could keep SBP at a lower level for a long time period.

hydrolysate derived fromα-casein；spontaneously hypertensive rat；systolic blood pressure

TS252.1

A

1002-6630(2010)19-0335-04

2010-03-08

天津市重點科技支撐計劃項目(07ZCKFNC00200)

張艷(1982—)，女，碩士研究生，研究方向為專用功能性食品。E-mail：zhangyandaphne@163.com

*通信作者：胡志和(1962—)，男，教授，碩士，研究方向為專用功能性食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn