高效液相色譜法同時測定元胡止痛片中歐前胡素、延胡索乙素與異歐前胡素的含量

王云龍 ，陳曉輝 ，許世偉 ，邵禮梅 ，李延雪

（1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016；2.雞西市藥品檢驗所，黑龍江雞西 158100）

元胡止痛片為《中國藥典》2005年版一部品種，由延胡索（醋制）與白芷兩味中藥組成，具有理氣、活血、止痛的功效。歐前胡素、延胡索乙素、異歐前胡素均是元胡止痛片中的有效成分。目前，現(xiàn)版藥典[1]僅對其中的延胡索乙素進(jìn)行了質(zhì)量控制，文獻(xiàn)報道[2-4]的大多是對其一種或兩種成分進(jìn)行含量測定，同時測定元胡止痛片中歐前胡素、延胡索乙素、異歐前胡素的含量的方法未見報道。本文采用高效液相色譜法同時測定元胡止痛片中歐前胡素、延胡索乙素與異歐前胡素的含量，方法簡便、快速、專屬性強(qiáng)、分離度高，可作為元胡止痛片的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HP1100高效液相色譜儀（四元泵、紫外檢測器、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、HP Chemstation色譜工作站）；Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；AG285 電子分析天平。

1.2 試藥

延胡索對照品、歐前胡素對照品和異歐前胡素對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；水為雙重蒸餾水，甲醇為色譜純；元胡止痛片由四川蜀中制藥有限公司提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH值至6.5）（61∶39）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 ml/min。柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取歐前胡素、延胡索乙素和異歐前胡素4.74、2.05、7.50 mg，置 100 ml量瓶中，加甲醇溶液適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取元胡止痛片20片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取約10片重，精密稱定，置100 ml錐形瓶中，精密加入加濃氨試液-甲醇溶液（1∶20）50 ml，稱定重量，冷浸 1 h，加熱回流 1 h，放冷，稱定重量，用濃氨試液-甲醇溶液（1∶20）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別取歐前胡素、延胡索乙素和異歐前胡素混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶液，按上述色譜條件進(jìn)行試驗，考察系統(tǒng)適用性。HPLC色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2”項下歐前胡素、延胡索乙素和異歐前胡素混合對照品溶液 3、5、7、9、11、13 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定色譜峰面積，以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算回歸方程，結(jié)果表明歐前胡素在0.047 4～0.284 4 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=3×106±+1.22×104（r=0.999 9）；延胡索乙素在0.020 5～0.123 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=4×106±+1.46×104（r=0.999 8）；異歐前胡素在0.075 0～0.450 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=2×106±-1.48×104（r=1.000 0）。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下對照品溶液 10 μl，重復(fù)進(jìn)樣 5 次，按上述色譜條件測定色譜峰面積，歐前胡素的RSD=1.5%，延胡索乙素的RSD=0.3%，異歐前胡素的RSD=1.8%，結(jié)果表明本法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.3”項下供試品溶液，分別于放置 0、2、4、6、8 h 后，注入液相色譜儀，測定色譜峰面積，歐前胡素的RSD=0.4%，延胡索乙素的RSD=1.3%，異歐前胡素的RSD=0.8%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批樣品，按“2.3”項下方法制備5份供試品溶液，在上述色譜條件下分別測定色譜峰面積，歐前胡素的RSD=1.6%，延胡索乙素的RSD=1.9%，異歐前胡素的RSD=2.1%，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗

取已知含量的樣品5份，每份20片，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密量取5 ml置5個25 ml量瓶中，分別精密加入上述混合對照品溶液5 ml，在上述色譜條件下測定，進(jìn)樣量20 μl，計算回收率，歐前胡素的平均回收率為98.6%，RSD=0.7%；延胡索乙素的平均回收率為97.5%，RSD=0.2%；異歐前胡素的平均回收率為96.8%，RSD=1.1%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of recovery test(n=5)

2.10 樣品測定

取5批樣品，照“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法計算相應(yīng)元胡止痛片中歐前胡素、延胡索乙素和異歐前胡素的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（%，n=5）Tab.2 Content determination results of samples(%,n=5)

4 討論

4.1 提取方法選擇

本研究比較了超聲提取法與回流提取法對歐前胡素與異歐前胡素提出率的影響［5-6］，回流提取法延胡索乙素含量高于超聲提取法延胡索乙素含量，歐前胡素與異歐前胡素含量無明顯差異，故采用回流提取法。

4.2 色譜條件的選擇

對流動相甲醇與水的比例進(jìn)行了考察，結(jié)果表明當(dāng)甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 值至 6.5）（80∶20）、甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 值至 6.5）（70∶30）時，延胡索乙素、歐前胡素與異歐前胡素與其他組分分離效果不好，甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH值至 6.5）（50∶50）洗脫時間較長，甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 值至 6.5）（61∶39）延胡索乙素、歐前胡素與異歐前胡素與其他組分分離效果良好，保留時間適宜，故選擇作為流動相，柱溫分別考察了25℃、30℃、35℃，結(jié)果表明35℃時柱壓較小，分離效果好。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:363.

[2]陳洪寶,李彩榮,楊慶勝,等.高效液相色譜法測定元胡止痛片中延胡索乙素的含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,(9):1701-1702.

[3]孫巍,竇志英,高瓔.HPLC法同時測定元胡止痛片中3種有效成分的含量[J].天津中醫(yī)藥,2006,23(5):426-428.

[4]王洪志,李惠芬,周靜,等.HPLC法測定元胡止痛片中歐前胡素和異歐前胡素[J].中草藥,2007,38(7):1018-1019.

[5]周岐勛,李健和,徐幸民.高效液相色譜法測定鹽酸甲氯芬酯分散片含量及有關(guān)物質(zhì)[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2009,16(4):73-76.

[6]關(guān)強(qiáng),王云龍,杜遵義.高效液相色譜法測定延胡索藥材中延胡索乙素的含量[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2009,16(4):78-79.