酪蛋白酶解制活性肽的工藝條件

張虎剛，張志翔，萬(wàn)端極，*

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011500；2.湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所，湖北武漢430068）

酪蛋白酶解制活性肽的工藝條件

張虎剛1，張志翔2，萬(wàn)端極2，*

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011500；2.湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所，湖北武漢430068）

選用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白制備活性肽。以水解度（DH），水解速度，水解時(shí)間（t）和分子量分布為指標(biāo)，探討對(duì)酶的底料濃度（E/S），底物濃度比（S），水解溫度（T），水解時(shí)間（t），4個(gè)因數(shù)對(duì)酶解效果的影響，確定最佳條件組合：水解溫度40℃，底物濃度：6%，酶底物濃度比：2%，水解時(shí)間：120 min。

酪蛋白；pH值；酶；底物濃度；溫度；時(shí)間

Abstract:This experiment choice pancreas enzyme to preparation bioactive peptides.Use Hydrolysis Degree,Hydrolysis rate,t,U distribution four point to experiment,choice best factor about substrate,substrate consentration,temperature,time of hydrolysis.Find best design：temperature：40,Substrate concentration：6%,enzyme consentration：2%,pH：7,hydrolysis time：120 min.

Key words：casein；pH；enzyme；substrate concentration；temperature；time

牛乳中蛋白質(zhì)含量為牛乳的3%～3.5%，主要包括酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵蛋白和一些具重要生理功能的酶類，其中酪蛋白占蛋白總量的78.8%。在酪蛋白中有4種主要形式,分別是αS-1酪蛋白，αS-2酪蛋白，β酪蛋白，γ酪蛋白。水解酪蛋白的酶類也有很多，本文重點(diǎn)研究一種動(dòng)物來(lái)源的蛋白水解酶—胰蛋白酶。胰蛋白酶專一作用于精氨酸、賴氨酸的羧基形成的肽鍵酪蛋白具有較強(qiáng)的水解度[1]。研究表明，當(dāng)分子量處于5000 u～10000 u時(shí)候的蛋白肽具有很強(qiáng)的生物活性[2]。因?yàn)樵诖饲暗脑囼?yàn)中通過(guò)高效液相色譜得出：當(dāng)水解度在20%～25%之間時(shí)，分子量主要分布在5000 u～10000 u左右。因此我們的目標(biāo)是找出適當(dāng)?shù)乃鈼l件將水解度控制在20%～25%之間。

1 材料與檢測(cè)方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白：為試劑干酪素，經(jīng)半自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定含氮量為13.12%，由湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院提供；胰蛋白酶：上海伯奧生物科技有限公司；HCl，NaOH等其他試劑均為分析純；HD-3紫外檢測(cè)儀，HI-2恒流泵上海滬西分儀器廠；ZD-2型pH計(jì)上海雷磁儀器廠；78HW-型恒溫磁力攪拌器江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；entrifuge 5810R離心機(jī)，美國(guó)產(chǎn)。

1.2 可溶性氮的測(cè)定（微量擴(kuò)散法）

取乳酪蛋白肽溶液5 mL，加入1 g消化催化劑和10 mL濃硫酸，消化至黃綠色，取出冷卻至室溫，加水定容。然后取5 mL加入到擴(kuò)散皿外室，并在擴(kuò)散皿內(nèi)室加入2 mL 2%硼酸溶液，再向外室加入4 mL 40%濃NaOH溶液，并迅速蓋上玻片。在室溫條件下放置24 h后，用標(biāo)準(zhǔn)的鹽酸溶液滴定硼酸溶液至紫羅蘭色。

式中：V1為空白所需標(biāo)準(zhǔn)酸體積，mL；V2為滴定待測(cè)液所需標(biāo)準(zhǔn)酸體積，mL；NH為標(biāo)準(zhǔn)酸溶液當(dāng)量濃度；0.014=1 mL當(dāng)量氮的克數(shù)。

1.3 水解度的測(cè)定一TCA法

10 mL酶解物中加入10 mL TCA，在水浴中加熱30 min，然后在4000 r/min離心15 min。取上清液，蛋白質(zhì)總氮和上清液可溶性氮由2.1中方法計(jì)算。

式中：N1為空白試樣的含氮量，%；N2為乳酪蛋白的含氮量，%；N3為TCA處理后酶解液的含氮量，%。

1.4 水解速度的測(cè)定

水解速度=水解度/單位時(shí)間（g/min）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 酶濃度對(duì)水解度的影響[3]

酶濃度對(duì)水解度的影響，見(jiàn)圖1。

由圖1可以看出水解度隨酶濃度的增加而加大，但是不完全是按照呈線性關(guān)系遞增。水解前20 min，在幾種酶濃度條件下，水解度幾乎都是按照線性關(guān)系增加[4]。隨著時(shí)間增長(zhǎng)，酶濃度高的水解度增加較快，但是不太明顯，由圖1可以看出酶濃度在2.0 g/L時(shí)，水解度隨時(shí)間增長(zhǎng)最為明顯。因此，酶濃度選用2.0 g/L比較適合。

2.2 底物濃度，水解時(shí)間對(duì)水解度的影響

試驗(yàn)采用底物濃度為2%，但是考慮工業(yè)化生產(chǎn)和其經(jīng)濟(jì)效益，決定在試驗(yàn)中適當(dāng)?shù)募哟蟮孜餄舛?，試圖找到合適的底物濃度比，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在反應(yīng)0.5 h后底物濃度6%~8%的曲線幾乎重合，7%、8%的水解度比6%幾乎沒(méi)有明顯差別，而5%和曲線可以和6%的區(qū)分開，所以，底物濃度選用6%比較適合。同時(shí)認(rèn)為7%~8%產(chǎn)生底物抑制[5]。

從圖2還可以看出當(dāng)時(shí)間為2 h時(shí)，水解度幾乎達(dá)到最大值，2 h以后的水解度幾乎沒(méi)有增加。因此，將水解時(shí)間定為2 h是合適的。

2.3 底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系

底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系，見(jiàn)圖3。

圖3說(shuō)明了胰蛋白酶的水解體系中底物濃度與水解速度的關(guān)系，從中可以看出當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?%時(shí)候，體系出現(xiàn)了底物抑制現(xiàn)象[6]；所以把底物濃度定為 6%是合適的。在水解的 10、20、30、60、120 min的五個(gè)時(shí)間段都可以看出當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?%時(shí)，水解速度幾乎都出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。由此可見(jiàn)由于底物濃度達(dá)到一定時(shí)，底物分子的分布過(guò)于密集，不能和酶進(jìn)行有效接觸，這樣它們就不能完全的接受酶的催化位點(diǎn)[7]，從而表現(xiàn)為高底物抑制。

2.4 水解溫度與水解度關(guān)系

水解溫度與水解度關(guān)系，見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，從30℃開始，隨著溫度升高，水解度也加大[8]，在達(dá)到35℃時(shí)候趨于平緩，在40℃時(shí)水解度達(dá)到最大，然后水解度開始下降，45℃后下降幅度加大。因此，本試驗(yàn)將適合的水解溫度定為40℃。

2.5 pH值與水解度關(guān)系

在底物濃度為5%，酶濃度為2%，溫度40℃條件下，選用不同的pH值，分別酶解2 h，然后測(cè)定其水解度見(jiàn)圖5。

溶液的酸堿度對(duì)胰蛋白酶的酶活性影響較大，一旦酸性或堿性過(guò)大，都會(huì)抑制甚至滅去胰木瓜蛋白酶的活性[9]。當(dāng)溶液pH值在中性或偏弱酸弱堿條件，胰蛋白酶對(duì)乳酪蛋白有較高的水解度，由此可以看出胰蛋白酶是一種中性酶。因此，選用pH=7較為適宜。

3 多因素對(duì)水解度的效果

多因素對(duì)水解度的效果見(jiàn)表1。

表1 多因素對(duì)水解度的效果Table 1 Multifactorial experiment impact on DH

由統(tǒng)計(jì)分析表1可知，酶解溫度，酶解時(shí)間，酶用量，底物濃度4個(gè)因素中，酶濃度對(duì)水解度影響最大，溫度和底物濃度次之，反應(yīng)時(shí)間影響最小。而且還可以從圖中看出，當(dāng)選用方案6時(shí)，效果最好。即溫度為40℃，時(shí)間120 min，酶濃度2%，底物濃度6%時(shí)最好。

4 結(jié)論

1）蛋白質(zhì)類底物的水解與小分子類的底物的水解是不同的。并不是底物濃度越高越好，當(dāng)濃度達(dá)到一定時(shí)，隨著底物濃度的增加水解度不會(huì)增加。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí)，黏度增加，水解液中的酪蛋白不能和酶完全有效的接觸，造成水解速度下降。

2）由多因素正交試驗(yàn)可得：酶濃度對(duì)水解度影響最大，溫度和底物濃度次之，反應(yīng)時(shí)間影響最小。

3）酶的濃度與水解度是成正比的，但是酶濃度達(dá)到2%后，隨著酶濃度的增加水解度增加不多，所以從經(jīng)濟(jì)角度看2%的酶濃度是適合此反應(yīng)的。

4）根據(jù)本研究結(jié)果可知：胰蛋白酶水解酪蛋白的最佳底物濃度為6%，而胰蛋白酶濃度為2%，水解溫度為40℃，水解時(shí)間2 h，pH值為7。

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Casein Solution Process Conditions of Active Peptide Research

ZHANG Hu-gang1,ZHANG Zhi-xiang2,WAN Duan-ji2,*
（1.Inner Mongolia Mengniu Dairy（Group）Co.,Ltd,Hohhot 011500，Inner Mongolia,China；2.Institute of Membrane Technology of Hubei University of Technology,Wuhan 430068，Hubei,China）

2010-02-01

張虎剛（1975—），男（漢），高級(jí)工程師，碩士，研究方向：食品加工工藝。

*通信作者：萬(wàn)端極（1953—），男，教授。