雙酶復合水解對玉米肽物化性質(zhì)的影響

王曉杰，鄭喜群，劉曉蘭，柴云雷

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

雙酶復合水解對玉米肽物化性質(zhì)的影響

王曉杰，鄭喜群*，劉曉蘭，柴云雷

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

采用4種蛋白酶（Neutrase酶、Alcalase酶、Protamex酶、Flavourzyme酶）對高底物濃度（24%）玉米黃粉進行雙酶復合水解，研究復合水解對玉米肽的溶解性、起泡性、乳化性和黏度等物化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，Neutrase酶與Alcalase酶以及Protamex酶與Alcalase酶的復合效果最好，可有效提高玉米肽的物化性質(zhì)；復合水解后玉米肽在pH值4.0～7.0范圍內(nèi)具有較好的溶解性，pH值大于7.0時溶解性呈下降趨勢，其他物化性質(zhì)的變化規(guī)律基本與溶解性呈正相關(guān)；雙酶的酶解順序?qū)τ衩纂牡奈锘再|(zhì)影響較大。

玉米肽；雙酶；物化性質(zhì)

Abstract:The proteases（Neutrase,Alcalase,Protamex,Flavourzyme）were used to perform multi-hydrolysis of high CGM concentration（24%）.The effects of double proteases on physico-chemical properties,such as the solubility,foamability,emulsibility and viscosity of corn peptides were studied.The results showed that Neutrase protease adding Alcalase protease and Protamex protease adding Alcalase protease were optimal designs.In this condition the physico-chemical properties of corn peptides were increased.The solubility was good at pH 4.0-7.0 of corn peptides,and the solubility decreased at pH＞7.0.The other physico-chemical properties were positive correlation to the solubility.The adding order of the proteases had an obvious influence on physicochemical properties of corn peptides.

Key words：corn peptide;double enzyme;physico-chemical property

食品的功能性質(zhì)包括溶解性、乳化性、起泡性、黏度等物化性質(zhì)和各種生理活性。其中物化性質(zhì)與食品加工有著密切的關(guān)系，也與食品品質(zhì)的控制有緊密聯(lián)系[1]。例如：溶解性能好說明蛋白質(zhì)的水化作用強，可使蛋白質(zhì)均勻分布于整個體系中，提高食品的營養(yǎng)價值；乳化性能好可以維持食品體系的均勻與穩(wěn)定，進而延長食品的貨架時間；起泡性能好可以賦予食品疏松的結(jié)構(gòu)和良好的口感；黏度在調(diào)整食品特性方面發(fā)揮著重要的作用。所以，蛋白質(zhì)類產(chǎn)品在應(yīng)用于食品工業(yè)時，其物化性質(zhì)是食品加工過程中重要的性質(zhì)和質(zhì)量控制指標，也是其作為原輔料或添加劑進行食品加工的設(shè)計依據(jù)，對產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、口感有重大影響[2]。

玉米黃粉是玉米濕法生產(chǎn)淀粉過程中產(chǎn)量最大、蛋白質(zhì)含量最高的副產(chǎn)物，因玉米蛋白水溶性差等原因限制了其在食品工業(yè)上的應(yīng)用。研究表明，酶法改性可改善玉米蛋白的溶解性。玉米肽是玉米蛋白的酶水解產(chǎn)物，由多種肽分子組成，具有降血壓[3-4]、抗氧化[5]、消除疲勞[6]、促進乙醇代謝[7-8]等生理活性，在食品領(lǐng)域顯示出了誘人的開發(fā)前景。但目前僅有一小部分玉米肽產(chǎn)品已經(jīng)面市，如促進乙醇代謝肽（又名醒酒肽），市場前景看好。玉米肽類產(chǎn)品在食品工業(yè)上還沒有得到廣泛的應(yīng)用，可能與其物化性質(zhì)研究的還不夠深入和全面有關(guān)。

本試驗采用雙酶復合法對玉米黃粉進行有效水解，在提高水解度和可溶性蛋白含量的同時，研究復合水解對玉米肽物化性質(zhì)的影響，為玉米肽類產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米黃粉由黑龍江省青岡縣淀粉廠提供，其中各組分的質(zhì)量分數(shù)為：蛋白質(zhì)55.05%，淀粉19.39%，水分 5%；Neutrase酶、Flavourzyme酶、Alcalase酶和Protamex酶均購自丹麥諾維信公司。

1.2 試劑

大豆油為市售，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

IKA T25型高剪切分散乳化機：德國IKA集團；BROOKFIRLD DV-C型流變儀：美國博勒飛公司；TV1901紫外可見分光光度計：北京譜析通用儀器有限公司。

1.4 方法

溶解性的測定：Folin-酚法和微量凱氏定氮法[9-10]；起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定：攪打法[11]；乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定：濁度法[12]；黏度的測定：DV-C流變儀，轉(zhuǎn)子型號S96，轉(zhuǎn)速100 r/min。

1.5 蛋白酶的最適酶解條件

在高底物濃度（24%）條件下，Alcalase酶：E：S3%、60 ℃、pH 8.5、2 h；Neutrase 酶：E：S 1%、45 ℃、pH 7.0、3 h；Flavourzyme 酶：E：S 5%、50 ℃、pH 6.0、1 h；Protamex酶：E：S 1%，50 ℃，pH 7.0，3 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 Alcalase酶與其他蛋白酶復合水解對玉米肽物化性質(zhì)的影響

表1 Alcalase酶與其他蛋白酶復合水解對黏度的影響Table 1 Effect of Alcalase adding other protease on viscosity of hydrolysates

第1階段水解，采用Alcalase酶（簡寫A酶），在其最適酶解條件下水解2 h后，分別加入Flavourzyme酶（簡寫F酶）、Neutrase酶（簡寫N酶）、Protamex酶（簡寫P酶），分別水解1、3、3 h，均以第2階段不加酶作為對照。水解后水解液于沸水浴中滅酶活5 min，在5000 r/min條件下離心10 min，去除水不溶性物質(zhì)獲得玉米肽的混合物，分別測定玉米肽的溶解性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性，乳化性及乳化穩(wěn)定性和黏度，試驗結(jié)果如圖1～圖3和表1所示。

由圖1可知，雙酶復合水解后，玉米肽的溶解性隨pH值的增大呈先增加后降低的趨勢，在pH值4.0～7.0范圍內(nèi)較好，在pH值＞7.0時開始下降。原因是隨著水解反應(yīng)的進行，水解液中-NH4+和-COO-含量增加，在堿性條件下離子化的-COO-與水的結(jié)合力弱于-COOH，使玉米肽的溶解性降低。3個組合中，Alcalase酶和Flavourzyme酶復合玉米肽的溶解性最好，達96%，比Alcalase單酶水解時提高29%，與Protamex酶及Neutrase酶復合玉米肽的溶解性相當，均比Alcalase單酶水解時低，分析原因：蛋白質(zhì)的溶解性受自身的疏水性和所帶電荷性質(zhì)的影響[13]，Alcalase酶的水解產(chǎn)物經(jīng)Neutrase酶和Protamex酶進一步水解，疏水性降低，且在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，復合水解產(chǎn)物在pH值7.0條件下絮凝沉淀相對較多，可能是玉米肽的等電點在pH7.0附近，使得復合水解后玉米肽的溶解性低于單酶水解。

由圖2和圖3可知，雙酶復合水解未能有效改善Alcalase酶水解產(chǎn)物的起泡性和乳化性，且起泡性和乳化性的變化規(guī)律與溶解性相反。蛋白質(zhì)的乳化性與其溶解性及表面疏水性等因素有關(guān)，Alcalase酶是內(nèi)切蛋白酶，作用位點是疏水性氨基酸，玉米醇溶蛋白中含有高比例的Ile、Leu、Ala等疏水性氨基酸，隨著酶解反應(yīng)的進行，包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸側(cè)鏈逐漸外露，使玉米蛋白的溶解性逐漸增大、表面疏水性增強、表面吸附能力提高。當加入大豆色拉油后，大量玉米肽會迅速擴散到油水界面，通過靜電排斥力阻止油滴的聚結(jié)，提高了乳化能力。起泡性除與蛋白質(zhì)的溶解性有關(guān)外，還受表面張力等因素的影響。酶解作用使反應(yīng)體系中水溶性蛋白含量增加，當受到急速機械攪拌時，大量氣體混入形成氣液界面，溶液中的蛋白質(zhì)快速吸附至氣液界面，表面張力降低，起泡性能增強。加入Flavourzyme酶后，玉米蛋白繼續(xù)水解，肽鏈末端的疏水性氨基酸被切除，親水性進一步增加，起泡及吸附油滴的能力下降，導致玉米肽的溶解性高但起泡性和乳化性低。

與單酶水解相比，Alcalase酶與Neutrase酶復合時玉米肽的泡沫穩(wěn)定性最好，60min后仍然維持有45%的起始泡沫體積，與Flavourzyme酶復合時最差，甚至為0，這是由于Flavourzyme酶具有外切酶活性，可將玉米蛋白水解成游離的氨基酸或寡肽，這些小分子物質(zhì)不足以穩(wěn)定液膜，導致薄層排水和破裂，使泡沫穩(wěn)定性降低。同時，水解后產(chǎn)生的小分子物質(zhì)不易吸附在油水界面形成的黏彈性膜上，界面膜厚度減少、強度下降，導致乳化穩(wěn)定性比Alcalase單酶水解時略微降低。

由表1可知，玉米肽黏度的變化規(guī)律也與溶解性相反，說明復合水解后玉米肽具有高溶解性低黏度的特點。黏度是流體流動性質(zhì)的指標，與蛋白質(zhì)的濃度、相對分子質(zhì)量、大小、形狀以及與溶劑的相互作用性質(zhì)等因素有關(guān)[2]。在雙酶復合水解過程中，玉米蛋白肽鍵逐漸裂解、肽鏈長度變短，使蛋白質(zhì)水化能力增強，同時，溶液中靜電荷量增加，肽分子之間的靜電排斥增強，阻止了蛋白質(zhì)分子之間的聚集，玉米肽的黏度下降。但與單酶水解相比，黏度的變化幅度不大，可根據(jù)此特性解決高蛋白流體食品膩口等口感問題。

2.2 Neutrase酶與其他蛋白酶復合水解對玉米肽物化性質(zhì)的影響

第1階段水解，采用Neutrase酶，在其最適酶解條件下水解3 h后，分別加入Flavourzyme酶、Alcalase酶、Protamex 酶，分別水解 1、2、3 h，其余操作同 2.1，試驗結(jié)果如圖4~圖6和表2所示。

表2 Neutrase酶與其他蛋白酶復合水解對黏度的影響Table 2 Effect of Neutrase adding other protease on viscosity of hydrolysates

由圖4可知，當Neutrase酶作用玉米黃粉3 h后，破壞了玉米蛋白緊密的二級結(jié)構(gòu)、多肽鏈部分展開，暴露出利于其他3種蛋白酶作用的位點，所以復合水解后玉米肽的溶解性均較Neutrase單酶作用時大幅度提高。其中，與Alcalase酶復合時溶解性最高，達97.85%，比Neutrase單酶水解時提高50%。Neutrase酶與Protamex酶復合效果最差，可能是因為二者均為中性蛋白酶，在作用位點上存在著競爭性抑制，使玉米肽的溶解性提高幅度較小。

由圖5、圖6和表2可以看出，復合水解后玉米肽的起泡性及泡沫穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性和黏度的變化規(guī)律均與溶解性呈正相關(guān)。溶解性是蛋白質(zhì)最重要的物化性質(zhì)之一，是其他物化性質(zhì)得以發(fā)揮的先決條件。溶解性能好，說明反應(yīng)體系中水溶性蛋白含量多，起泡性能增強、同時吸附在油-水界面的蛋白多，形成的乳狀液界面面積大，乳化活力高。急速攪拌時，多肽分子相對運動時產(chǎn)生的位阻增大，黏度增加。綜合考慮，Neutrase酶和Alcalase酶復合效果較好。

2.3 Flavourzyme酶與其他蛋白酶復合水解對玉米肽物化性質(zhì)的影響

第1階段水解，采用Flavourzyme酶，在其最適酶解條件下水解1 h后，分別加入Protamex酶、Alcalase酶和 Neutrase 酶，分別水解 3、2、3 h，其余操作同 2.1，試驗結(jié)果如圖7~圖9和表3所示。

表3 Flavourzyme酶與其他蛋白酶復合水解對黏度的影響Table 3 Effect of Flavourzyme adding other protease on viscosity of hydrolysates

由圖7可知，F(xiàn)lavourzyme單酶水解時，玉米肽的溶解性受pH值的變化影響較小，在試驗pH值2.0~9.0范圍內(nèi)未出現(xiàn)等電點。雙酶復合水解后，玉米肽在pH值4.0附近出現(xiàn)等電點，此時水解產(chǎn)物中-NH4+和-COO-所帶凈電荷數(shù)相等，導致此處的溶解性最低。由于Flavourzyme酶酶解效率低，反應(yīng)體系中水溶性蛋白質(zhì)含量少，玉米肽的物化性質(zhì)較差，起泡性及泡沫穩(wěn)定性僅為14%和0。與其他3種蛋白酶復合水解，對玉米肽的溶解性提高幅度相對較小，使得乳化性和乳化穩(wěn)定性和黏度的提高幅度也較小，但起泡性及泡沫穩(wěn)定性明顯改善，尤其與Alcalase酶復合時二者分別提高160%和61%。說明蛋白質(zhì)的起泡性能不僅與水溶性的蛋白質(zhì)有關(guān)，保留一定折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)在泡沫形成及穩(wěn)定過程中也起著有益的作用[14]。

2.4 Protamex酶與其他蛋白酶復合水解對玉米肽物化性質(zhì)的影響

第1階段水解，采用Protamex酶，在最適酶解條件下水解3h后，分別加入Flavourzyme酶、Neutrase酶、Alcalase酶，分別水解 1、3、2 h，其余操作同2.1，試驗結(jié)果如圖10~圖12和表4所示。

由圖10~圖12和表4可知，Protamex酶處理后玉米肽的物化性質(zhì)較差，溶解性僅為15%。雙酶復合水解后，玉米肽的物化性質(zhì)均有不同程度的改善。其中與Alcalase酶的復合效果最好，在酸性條件下溶解性比單酶水解時提高56%，起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別提高182%和96%，乳化性提高18%，但乳化穩(wěn)定性提高幅度小。雙酶水解后獲得的小分子物質(zhì)使油狀微粒周圍的蛋白質(zhì)層不穩(wěn)定，不能有效防止油滴的聚結(jié)，乳化穩(wěn)定性降低。綜合考慮，Protamex酶與Alcalase酶復合效果較好。

表4 Protamex酶與其他蛋白酶復合水解對黏度的影響Table 4 Effect of Protamex adding other protease on viscosity of hydrolysates

3 結(jié)論

Neutrase酶與Alcalase酶及Protamex酶與Alcalase酶復合水解可有效改善玉米肽的物化性質(zhì)，其中溶解性在pH值4.0～7.0范圍內(nèi)較大，pH值大于7.0時呈下降趨勢，其他性質(zhì)的變化規(guī)律基本與溶解性呈正相關(guān)。所以，玉米肽作為食品添加劑和乳化劑應(yīng)用于食品行業(yè)時，需要選擇低于7.0的pH值，這樣有利于制造出高溶解性、起泡性和乳化性、低黏度的產(chǎn)品，并改善產(chǎn)品的口感和外觀。

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The Effect of Double Proteases Multi-hydrolysis on Physico-chemical Properties of Corn Peptides

WANG Xiao-jie，ZHENG Xi-qun*，LIU Xiao-lan，CHAI Yun-lei
（Heilongjiang Key Laboratory of Agricultural Products Processing，College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，Heilongjiang,China）

2010-05-30

黑龍江省自然科學基金（B200919）

王曉杰（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。