青藏高原油菜蜂花粉中脂肪酸的提取及GC分析

匡勇嬌，石玉平，任世霞，周小玲，王永寧，*，梅后敏

（1.青海師范大學(xué)化學(xué)系，青海西寧810008；2.青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，青海西寧810008）

青藏高原油菜蜂花粉中脂肪酸的提取及GC分析

匡勇嬌1，石玉平1，任世霞1，周小玲1，王永寧1，*，梅后敏2

（1.青海師范大學(xué)化學(xué)系，青海西寧810008；2.青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，青海西寧810008）

以石油醚為溶劑，通過正交試驗(yàn)確定青藏高原油菜蜂花粉中的脂肪油最佳提取條件為：浸提時(shí)間為12 h，花粉重量與溶劑體積的比值為1∶10（g/mL），花粉粒度為大于40目。提取的脂肪油含量進(jìn)行對比，結(jié)果表明：破壁花粉中脂肪油的含量高于未破壁花粉。提取的花粉油進(jìn)行甲酯化處理，利用氣相色譜法分析，油菜蜂花粉脂肪油的主要成分為：亞麻酸、油酸、棕櫚酸、亞油酸、芥酸等，破壁花粉油中不飽和脂肪酸的含量要比未破壁花粉油中的不飽和脂肪酸的含量高。

油菜蜂花粉；脂肪酸；石油醚；提??；GC

Abstract:The optimum extraction conditions of fatty acids in rape bee pollen of the Qinghai-Tibet Plateau was determined by orthogonal experiments with petroleum ether solvent：extraction time was 12 h,the ratio of the pollen weight and solvent volume was 1∶10（g/mL）,the grain size of pollen was greater than 40 mesh.Comparing the content of fatty oil extracted,the result showed that the content of the wall-broken pollen fatty oil is higher than that of the wall-unbroken pollen fatty oil.The pollen oils extracted were methylated,analyzed by GC-MS,are the chief components of Rape bee pollen fatty oils were linolenic acid,oleic acid,Hexadecanoic acid,linoleic acid,erucic acid,etc.,the unsaturated fatty acids content of the wall-broken pollen oil is higher than that of the wall-unbroken pollen oil.

Key words：rape bee pollen;fatty acid;petroleum ether;extraction;GC

花粉是一種營養(yǎng)最全面的食療佳品，具有強(qiáng)體力增精神，迅速消除疲勞和美容、抗衰老等作用?；ǚ垩芯渴且婚T生命科學(xué)，對花粉營養(yǎng)和抗衰老作用活性物質(zhì)的探索將窺測大自然的奧秘。我國花粉資源豐富，應(yīng)及時(shí)開發(fā)，充分利用，我們在花粉學(xué)方面應(yīng)迎頭趕上。

蜂花粉是蜜蜂從植物花朵上采集花粉的過程中加入一些花蜜和唾液，以使花粉黏集成團(tuán)，即形成花粉團(tuán)。蜂花粉是自然界賦予人類的優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)源，含有的200余種營養(yǎng)成分，是人體必需氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、多酚類和黃酮類物質(zhì)、多糖等活性物質(zhì)[1]，所以被稱為是最完美的營養(yǎng)保健食品之一[2]?；ǚ壑械牟伙柡椭舅嶂饕獮閬喡樗岷蛠営退醄3]。不飽和脂肪酸尤其是多不飽和脂肪酸不僅在維護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用,而且在治療心血管疾病、促進(jìn)細(xì)胞的生長、抗癌以及免疫調(diào)節(jié)等方面功效顯著，而亞油酸及亞麻酸被公認(rèn)為人體必需的脂肪酸（EA），在人體內(nèi)可進(jìn)一步衍化成具有不同功能作用的高度不飽和脂肪酸，如AA、EPA、DHA等[4]。其中最重要的是EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸），EPA是體內(nèi)三烯前列腺素前體，DHA是大腦、視網(wǎng)膜等神經(jīng)系統(tǒng)磷脂的主要成分[5]。

青藏高原地區(qū)油菜蜂花粉資源量十分豐富，具有無化學(xué)和生物污染的特點(diǎn)，但因受高原寒冷、干旱和缺氧等惡劣氣候的影響，其花粉孢子壁通常異常堅(jiān)硬，以適應(yīng)不良的氣候條件。破壁是準(zhǔn)確測定花粉中活性物質(zhì)的基本保證，從而使花粉中的營養(yǎng)物質(zhì)容易釋放，達(dá)到提取完全的目的。采用生物酶解法對青藏高原產(chǎn)油菜蜂花粉進(jìn)行破壁[6]，利用石油醚提取，采用氣相色譜法(GC)對青海產(chǎn)油菜蜂花粉及破壁花粉的脂肪酸成分進(jìn)行較全面的測定，比較它們之間的變化，意為青藏高原油菜蜂花粉的開發(fā)、利用提供參考。

1 材料、試劑、儀器

1.1 材料

油菜蜂花粉分別購自青海湟中縣、祁連縣和青海湖地區(qū),50℃真空干燥至恒重后備用。

1.2 主要試劑

棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸（氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)）；石油醚、正己烷、甲醇、氫氧化鈉（試劑均為分析純）；復(fù)合酶、水為蒸餾水。

1.3 主要儀器

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；7890A氣相色譜儀，Sepu3000色譜工作站。

2 方法

2.1 花粉的預(yù)處理

采用生物酶法將花粉進(jìn)行破壁，這種方法在一定溫度和pH值的條件下，通過控制花粉量與生物酶的量之比、花粉量與水量之比，花粉破壁率達(dá)到90%以上。破壁花粉在自然條件下晾干后，置于真空干燥箱中在一定溫度下烘干。將烘干的破壁和未破壁的花粉分別碾碎過篩（8目～20目為粗顆粒；20目～40目為中顆粒；大于40目為細(xì)顆粒），分成3種（粗、中、細(xì)）不同的粒度。

2.2 花粉脂肪油的提取

花粉油常用的提取方法有索氏提取法、超聲法提取、冷浸法提取[7]、超臨界CO2萃取技術(shù)[8]。在花粉脂肪油的提取過程中,為了避免高溫對有效成分的破壞，采用冷浸法在常溫常壓下以石油醚為提取溶劑，在室溫條件下進(jìn)行花粉油的提取。精密稱取樣品10 g于碘量瓶中,以石油醚為溶劑在室溫下浸提一定的時(shí)間后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，再在真空干燥箱中干燥至恒重得到花粉脂肪油。

2.3 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以確定最佳浸提條件

2.3.1 試驗(yàn)因素水平表設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇溶劑用量、浸提時(shí)間、花粉粒度3個(gè)因素為考察對象，每個(gè)因素確定3個(gè)水平，采用L（933）正交表安排試驗(yàn)，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.3.2 破壁花粉正交試驗(yàn)

精密稱取樣品10 g，以石油醚為溶劑，按正交表進(jìn)行試驗(yàn)，稱重并計(jì)算產(chǎn)率，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9(33)orthogonal test

從表2中數(shù)據(jù)可以看出，最佳提取條件為A3B3C3，即提取時(shí)間為36 h，溶劑用量為150 mL，花粉粒度＞40目時(shí)是最佳提取條件。

2.3.3 未破壁花粉正交試驗(yàn)

方法同2.3.2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

從表3中數(shù)據(jù)可以看出，最佳提取條件為A3B3C3,即提取時(shí)間為36 h,溶劑用量為150 mL,花粉粒度＞40目時(shí)是最佳提取條件。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of L9(33)orthogonal test

2.4 甲酯化[9]

脂肪酸甲酯化條件：取脂肪油0.5 mL，分別加入2.0 mL正己烷和1.0 mL氫氧化鈉甲醇溶液（0.5 mol/L），置水浴上70℃回流10 min，取出冷卻后，移置刻度試管中，加水至10 mL，振蕩、超聲提取、離心。取上層清液進(jìn)行GC分析。

2.5 GC分析條件

分析條件：純度99.99%的氮?dú)鉃檩d氣；FFAP柱（30 m×0.32 mm×0.33 μm）；柱初溫 100℃，以 10℃/min升溫速率升至280℃，保溫15 min；進(jìn)樣口溫度280℃；檢測器溫度（FID）280 ℃；進(jìn)樣量 1 μL，分流比為 50∶1。

將粗脂肪甲酯化處理后上機(jī)分析,得到油菜蜂花粉油的色譜圖（見圖1，圖2）。

以保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照、分析確認(rèn)各種脂肪酸?；衔锒堪捶迕娣e歸一化計(jì)算出各峰面積的相對百分含量結(jié)果分別見表4。

表4 油菜蜂花粉脂肪酸組成及含量Table 4 Identified chemical components of fatty acids extracted from rape bee pollen

3 結(jié)果與討論

3.1 破壁花粉油中的不飽和脂肪酸的含量高

從表4可以看出，在鑒定出的脂肪酸成分中，破壁和未破壁花粉中亞麻酸含量分別占總脂肪酸的30.59%和25.44%，兩者的不飽和脂肪酸的總含量都較高，而且破壁花粉油中的不飽和脂肪酸的含量要比未破壁花粉油中的不飽和脂肪酸的含量高。這可能是通過破壁使細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸容易釋放出來的緣故。

3.2 提取時(shí)間對脂肪酸提取的影響

由表2和表3數(shù)據(jù)可以看出，雖然提取率隨著時(shí)間的增加，提取率逐步提高，但增加幅度并不大，考慮到生產(chǎn)周期，因此提取時(shí)間確定為12 h為宜。

3.3 提取次數(shù)對提取率的影響

在最佳提取條件下第1次浸提所得粗脂肪占油菜破壁蜂花粉干重的約8.7%，未破壁的粗脂肪占油菜未破壁花粉干重的約7.8%。將第1次浸提的濾渣在相同條件下再浸提2次，第2次油的得率約為花粉干重的0.3%左右，第3次油的得率約為0.1%?？紤]到提取劑的損耗及提取成本，提取3次為最佳提取次數(shù)。

3.4 花粉粒度對提取率的影響

花粉粒度為細(xì)時(shí)提取率最高，顆粒度為粗時(shí)油的提取率最低。當(dāng)碾碎的破壁和未破壁花粉的粒度大于100目時(shí)，提取率反而下降，這可能是細(xì)的顆粒度在浸取時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀，導(dǎo)致花粉與提取液接觸的比表面降低所致。因此提取劑與花粉充分接觸是提高提取率的先決條件。

3.5 最佳提取條件分析

對破壁和未破壁花粉考慮到實(shí)際生產(chǎn)條件及降低溶劑的用量，其最佳提取條件為12 h，花粉與提取劑的固液比（g/mL）為1∶10，花粉的顆粒度大于40目為最佳提取條件。

4 結(jié)論

采用冷浸法提取花粉中的脂肪油，設(shè)備簡單，操作方便，適宜于工廠生產(chǎn)。而且青藏高原地區(qū)油菜蜂花粉資源量十分豐富，具有很好的開發(fā)價(jià)值。

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Extraction and GC Analysis of Fatty Acids in Rape Bee Pollen of the Qinghai-Tibet Plateau

KUANG Yong-jiao1,SHI Yu-ping1,REN Shi-xia1,ZHOU Xiao-ling1,WANG Yong-ning1，*,MEI Hou-min2
（1.Chemistry Department，Qinghai Normal University，Xining 810008，Qinghai,China；2.College of Life and Geographic Sciences，Qinghai Normal University，Xining 810008，Qinghai,China）

2009-12-02

青海省重點(diǎn)科技攻關(guān)資助項(xiàng)目（2002-N-119）

匡勇嬌（1984—），女（漢），碩士研究生，研究方向：生物無機(jī)化學(xué)。

*通信作者：王永寧（1951—），男，教研室主任，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。