鹽地堿蓬提取物抗氧化活性的研究

張澤生，牟浩，趙璐，趙麗，錢俊

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

鹽地堿蓬提取物抗氧化活性的研究

張澤生，牟浩，趙璐，趙麗，錢俊

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

研究鹽地堿蓬提取物的抗氧化活性。以鹽地堿蓬可食用部分的乙醇提取物作為研究對(duì)象，用體外抗氧化方法研究該提取物的抗氧化活性，并對(duì)其黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)對(duì)不同生長(zhǎng)期的鹽地堿蓬的抗氧化活性進(jìn)行研究。不同月份采摘的鹽地堿蓬樣品的抗氧化活性不同，抗氧化活性的強(qiáng)弱與其黃酮含量變化成正相關(guān)，但呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，黃酮含量在7月份植株顏色由綠變紅之前達(dá)到最高，且該月份提取物表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。

鹽地堿蓬；抗氧化活性；黃酮

Abstract:To study the antioxidant activity of extracts from Suaeda salsa.To study the ethanol extracts of edible part of Suaeda salsa with the antioxidant mode in vitro.And compare the content of flavanols a with the antioxidant activity,then research the further activity of the most active extract in the all development months.The activity of all samples fluctuates in the same trend with the content of flavanols,and to the top in July before Suaeda salsa turning green into red,the extract of July shows the good antioxidant activity.

Key words：Suaeda salsa；antioxidative activities；flavanol

鹽地堿蓬（Suaeda salsa）又名翅堿蓬、黃須菜。為藜科一年生草本植物，野生于海涂或鹽場(chǎng)的鹽灘之上，是典型的鹽地指示植物。世界上堿蓬約有100多種，廣泛分布于亞洲、歐洲，我國(guó)有20多種，生長(zhǎng)在我國(guó)東北、西北、華北及沿海各省的海濱、荒漠、河邊、洼地、草原、湖邊及鹽堿土地區(qū)。鹽地堿蓬營(yíng)養(yǎng)成分豐富，無(wú)污染，被稱為標(biāo)準(zhǔn)的“綠色食品”[1]。

氧參與生命活動(dòng)的同時(shí)也產(chǎn)生氧自由基，體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢與細(xì)胞的損傷和疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，如動(dòng)脈粥樣硬化、肝病、糖尿病、機(jī)體衰老、癌癥等[2-3]。隨著氧自由基和抗氧化理論研究工作的深入，越來(lái)越多的國(guó)家已限制使用合成抗氧化劑。從天然物質(zhì)中尋找高效、低毒的天然抗氧化劑已成為人們關(guān)心的熱點(diǎn)。截止2009年,從鹽生植物——堿蓬中提取抗氧化活性物質(zhì)的研究報(bào)道相對(duì)較少。

鹽地堿蓬的抗氧化活性直接取決于其所含物質(zhì)的種類與含量，而這與堿蓬的生長(zhǎng)期有著密切的聯(lián)系。本研究從不同生長(zhǎng)時(shí)期的鹽地堿蓬中提取抗氧化活性物質(zhì)，并使用不同方法評(píng)價(jià)其抗氧化性，旨在為鹽地堿蓬作為天然抗氧化劑來(lái)源的可行性和保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 原料

鹽地堿蓬：生長(zhǎng)于天津經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)河灘，取中上部可食用嫩葉，60℃下鼓風(fēng)干燥，將烘干后的樣品粉碎成粉末，密封保藏備用。

1.2 試劑與儀器

魯米諾（98%）：美國(guó)ACROS ORGANICS出品；蘆丁：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；DPPH：Fluka公司；乙醇；鹽酸；氫氧化鈉；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；碳酸氫鈉；水楊酸；30%H2O2；沒(méi)食子酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UVmini-1240紫外/可見分光光度計(jì)：日本島津公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HHS11-B電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠；LGJ0.5真空冷凍干燥機(jī)：Thermo Electron Corporation；MR23i冷凍離心機(jī)：法國(guó)Jouan；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法

2.1 鹽地堿蓬抗氧化活性成分的提取

稱取不同生長(zhǎng)期1 g烘干粉碎后的鹽地堿蓬樣品各2份進(jìn)行熱回流提取，加入65%的乙醇溶液50 mL，提取溫度為75℃，提取時(shí)間為4 h，提取2次，趁熱過(guò)濾，合并濾液，將第1份提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮至原體積的1/3，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，至于4℃冰箱中冷藏，備用。將第2份提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮至無(wú)有機(jī)溶劑后，凍干，備用。

2.2 黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al（NO）3方法測(cè)定[4]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，由吸光度對(duì)濃度建立回歸方程：y=1408.6x-2.1606，相關(guān)系數(shù)：r=0.9997，式中：x為吸光值，y為黃酮濃度（μg/mL）。以該曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定各月份提取物中黃酮的含量。

2.3 不同生長(zhǎng)期鹽地堿蓬提取物抗氧化活性的比較

2.3.1 總抗氧化活性的評(píng)價(jià)

采用鐵還原/抗氧化能力（Ferric Reducing/AntioxidantPower，F(xiàn)RAP）分析法[5]。取一定量上述第1組溶液，加入3.6 mL TPTZ工作液（由0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液 25 mL，10 mmol/L TPTZ 溶液 2.5 mL，20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL組成），充分混勻后，37℃水浴反應(yīng)10 min，于593 nm處測(cè)定吸光度，以1.0 mmol/L FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)樣，樣品抗氧化活性（FRAP value）以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。

2.3.2 對(duì)DPPH自由基的清除作用[6]

取1 mL1.5×10-4mol/L DPPH甲醇溶液，加入1 mL上述第1份溶液，搖勻后室溫放置。30 min后于517 nm下測(cè)定吸光度。

樣品對(duì)DPPH自由基的清除率K=1-（Ai-Aj）/A0×100%，式中：Ai為1 mL DPPH溶液+1 mL提取液吸光度；Aj為1 mL提取液+1 mL甲醇的吸光度；A0為1 mL DPPH溶液+1 mL甲醇的吸光度。

2.3.3 還原力的測(cè)定（普魯士蘭法）[7]

取一定量上述第1組溶液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和 2.5 mL 1%K3Fe（CN）6溶液，于50℃水浴反應(yīng)20 min后迅速冷卻，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，以5000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL雙蒸水和1 mL 0.1%的FeCl3溶液，充分混勻，靜置10 min后700 nm處測(cè)定吸光度，以A700nm代表還原力強(qiáng)度，A越大，代表還原力越大。

2.4 鹽地堿蓬7月份提取物抗氧化活性的評(píng)價(jià)

將冷凍干燥后的7月份樣品粉末配制成不同濃度的水溶液，待用。

2.4.1 清除超氧陰離子

2.4.1.1 紫外分光光度法[8-9]

采用鄰苯三酚自氧化法。

測(cè)定步驟：取4.5 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中，在25℃水浴中預(yù)熱20 min，加入1 mL供試液和0.5 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚，混勻后在25℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，立即用0.1 mL 8 mol/L HCl終止反應(yīng)，并在波長(zhǎng)320 nm處測(cè)定吸光度（A）值，對(duì)照組用0.5 mL蒸餾水代替鄰苯三酚，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)立試劑空白管。

清除率S=1-（Ai-Aj）/A0×100%，式中：A0為空白對(duì)照；Ai為提取液的吸光值；Aj為無(wú)鄰苯三酚時(shí)提取液的吸光值。

2.4.1.2 化學(xué)發(fā)光法[10]

測(cè)定樣品對(duì)堿性鄰苯三酚體系（非酶體系）產(chǎn)生O2-·的清除作用。具體方法是：在反應(yīng)池中依次加入0.5 μL 0.2 mmol/L的魯米諾溶液（用 pH=10.16，0.1 mol/L的 Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制）、50 μL不同濃度的供試液，混勻后迅速置于發(fā)光儀檢測(cè)器中，用0.1 mL 6 mmol/L的鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L的HCl配制）啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定6 s內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度CP0，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，水做空白對(duì)照，測(cè)其CP1，按下式計(jì)算樣品液的清除率：清除率=（CP0-CP1）/CP0×100%。

2.4.2 清除羥自由基

2.4.2.1 紫外分光光度法[11]

在試管中依次加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，一定量的供試液，2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，搖勻，靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，靜置30 min后以5000 r/min離心10 min，于510 nm處測(cè)其吸光值，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。清除率S=1-（Ai-Aj）/A0×100%，式中：A0為空白對(duì)照；Ai為提取液的吸光值；Aj為無(wú)水楊酸時(shí)提取液的吸光值。

2.4.2.2 化學(xué)發(fā)光法[12]

用魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定樣品對(duì)Fenton型反應(yīng)產(chǎn)生的·OH的清除作用。具體方法是：向反應(yīng)池中依次加入 40 μL 2 mmol/L 的抗壞血酸、70 μL 2 mmol/L的 CuSO4溶液、15 μL 10 mmol/L 的魯米諾溶液、50 μL 0.2 mol/L pH=7.8的磷酸緩沖液、20 μL不同濃度的供試液，混勻后，迅速置于發(fā)光儀檢測(cè)器中，80 μL過(guò)氧化氫啟動(dòng)反應(yīng)，同時(shí)記錄第6秒時(shí)發(fā)光強(qiáng)度出現(xiàn)的峰值CP0，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，水做空白對(duì)照，測(cè)其CP1，羥自由基的清除率=（CP0-CP1）/CP0×100%。

2.4.3 清除過(guò)氧化氫[13-14]

采用H2O2-魯米諾-碳酸緩沖液（pH 9.5）體系檢測(cè)H2O2：在反應(yīng)池中依次加入50 μL不同濃度的供試液、50 μL 10 mmol/L的魯米諾溶液（用 pH=9.5，0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制）、100 μL碳酸緩沖液，50 μL 0.15%過(guò)氧化氫啟動(dòng)反應(yīng)，連續(xù)測(cè)定反應(yīng)強(qiáng)度6 s，至出現(xiàn)峰值，記錄發(fā)光強(qiáng)度（CL），以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)光抑制率按下式計(jì)算：清除率=1-樣品CL/對(duì)照CL×100%（為防止玻璃儀器沾染有機(jī)物，抗氧化試驗(yàn)中所有玻璃儀器均采用以下步驟處理：a.用洗液浸泡；b.自來(lái)水沖洗；c.發(fā)煙硝酸浸泡 1 h 以上；d.蒸餾水煮沸；f.蒸餾水漂洗用3次后使用）。

3 結(jié)果與分析

3.1 鹽地堿蓬生長(zhǎng)期提取物黃酮含量

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物，在510 nm波長(zhǎng)下紫外分光光度法測(cè)定吸光值的結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，在1年的生長(zhǎng)中，不同月份的鹽地堿蓬乙醇提取物中總黃酮含量存在差異，在由綠變紅之前的7月達(dá)到最大值，其含量約是其它各月含量的3倍～5倍（以干基表示）。

3.2 鹽地堿蓬生長(zhǎng)期各月份提取物抗氧化活性的比較

3.2.1 總抗氧化活性的評(píng)價(jià)

在黃酮含量不同的條件下，不同生長(zhǎng)月份的鹽地堿蓬抗氧化能力見表1。

表1 不同生長(zhǎng)期鹽地堿蓬的總黃酮含量及FRAP值Table 1 The flavanols content and FRAP value of Suaeda salsa in different stage

從表1可知，不同生長(zhǎng)月份的鹽地堿蓬的抗氧化活性存在差異，其中7月份的樣品FRAP值最大，抗氧化活性最強(qiáng)，隨著提取物黃酮含量的增加，其總抗氧化活性也增大。

3.2.2 對(duì)DPPH自由基的清除作用

不同月份鹽地堿蓬的提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖2。

從圖2可看出，不同月份鹽地堿蓬的提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用存在差異，且變化趨勢(shì)與其黃酮含量變化趨勢(shì)一致。7月份提取物對(duì)該自由基的清除率已接近70%，說(shuō)明鹽地堿蓬提取物具有較高的DPPH自由基清除能力。

3.2.3 還原力的測(cè)定

不同月份鹽地堿蓬的提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖3。均有較強(qiáng)的清除能力，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，即濃度越大，抗氧化效果越好。

3.3.1.2 化學(xué)發(fā)光法

不同濃度的2種樣品加入到O2-·體系后，使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)對(duì)O2-·的清除能力見圖5。

從圖3可以看出，不同月份鹽地堿蓬的乙醇提取物的還原力強(qiáng)度與其清除DPPH自由基變化趨勢(shì)的一致性，且7月份提取物的還原力達(dá)到了最大值。

通過(guò)以上抗氧化模型可以看出，鹽地堿蓬提取物的抗氧化活性變化與其黃酮類物質(zhì)的含量變化相一致，說(shuō)明在該提取物的抗氧化活性成分中，黃酮類物質(zhì)起主要作用，并且7月份提取物中黃酮量最高，抗氧化活性也最強(qiáng)。

3.3 鹽地堿蓬生長(zhǎng)期7月份提取物抗氧化活性評(píng)價(jià)3.3.1 清除超氧陰離子

3.3.1.1 紫外分光光度法

不同濃度的2種樣品加入到O2-·體系后，使用紫外分光光度法對(duì)O2-·的清除能力見圖4。

2種樣品對(duì)O2-·的清除效果均隨其濃度的增大而增大，在低濃度時(shí)，7月份提取物的清除效果高于抗壞血酸。

3.3.2 清除羥自由基

3.3.2.1 紫外分光光度法

在不同鹽地堿蓬乙醇提取物濃度條件下，使用紫外分光光度法羥基清除效果見圖6。

由圖4可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)2種樣品對(duì)O2-·

從圖6中可看出，7月份提取物對(duì)·OH有一定的清除能力，且清除作用隨樣品濃度的增大而增大。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抗壞血酸的清除能力始終大于7月份提取物。

3.3.2.2 化學(xué)發(fā)光法

在不同鹽地堿蓬乙醇提取物濃度條件下，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)羥基清除效果見圖7。

圖7顯示，7月份提取物對(duì)·OH有較強(qiáng)的清除能力，且劑量效應(yīng)明顯，樣品濃度在1 mg/mL時(shí)，清除率走平，且清除能力高于抗壞血酸。

3.3.3 清除過(guò)氧化氫

在不同鹽地堿蓬乙醇提取物濃度條件下，過(guò)氧化氫清除效果見圖8。

由圖8可知，7月份提取物對(duì)H2O2有較強(qiáng)的清除能力，且清除率隨樣品濃度的增大而增大，當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)90%以上。在所選濃度范圍內(nèi)，7月份提取物對(duì)H2O2的清除效果與抗壞血酸相當(dāng)。

4 結(jié)論

本文研究表明，鹽地堿蓬的抗氧化活性與其含有的黃酮類物質(zhì)有著密切的關(guān)系，在其1年生長(zhǎng)期中，7月份黃酮含量最高，為每克干基98.78 mg/g，在各體外抗氧化模型中，其提取物具有較強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化活性，因此鹽地堿蓬可作為功能性食品的開發(fā)。

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Study on Antioxidant Activity of Suaeda Salsa Extract

ZHANG Zen-sheng,MU Hao,ZHAO LU,ZHAO Li,QIAN Jun
（College of Food Engineering and Biological Technology，Tianjin University of Science＆ Technology，Tianjin 300457,China）

2010-05-29

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2006BAD27B06）

張澤生（1956—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：功能食品及配料的研究與開發(fā)，天然產(chǎn)物的生物活性及機(jī)理研究。