正交試驗(yàn)法優(yōu)選肺熱清解口服液的提取工藝

劉佩沂 賴岳曉 田素英 劉永紅

1.廣東中山市黃圃人民醫(yī)院，廣東 中山 528429；2.廣東藥學(xué)院，廣東 中山 528458

正交試驗(yàn)法優(yōu)選肺熱清解口服液的提取工藝

劉佩沂1賴岳曉1田素英2劉永紅2

1.廣東中山市黃圃人民醫(yī)院，廣東 中山 528429；2.廣東藥學(xué)院，廣東 中山 528458

目的：優(yōu)選肺熱清解口服液的提取工藝。方法：以總黃酮含量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，考察加水量、提取時(shí)間、提取溫度、醇沉濃度4個(gè)因素對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果：最佳提取工藝為A3B1C1D2，即藥材加水10倍，提取時(shí)間1個(gè)小時(shí)，提取溫度80℃，醇沉濃度為70%。結(jié)論：正交試驗(yàn)法優(yōu)選肺熱清解口服液的提取工藝簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。

正交試驗(yàn)法；優(yōu)選；肺熱清解口服液；提取工藝

肺熱清解口服液（制劑批準(zhǔn)文號(hào)：粵中衛(wèi)藥制劑[98]第4163號(hào)）處方來(lái)源于中山市黃圃醫(yī)院臨床驗(yàn)方，由竹黃、川貝母、桑白皮、蘆根、野菊花、地龍干、車(chē)前子、冬瓜仁、瓜蔞皮等十味中藥組成，具有清熱宣肺、止咳平喘之功效。主治肺熱咳嗽，對(duì)于急性支氣管炎及肺部感染療效顯著。為進(jìn)一步將此方研制成為質(zhì)量穩(wěn)定、療效顯著、服用攜帶方便的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，本研究是以藥液中總黃酮含量作為試驗(yàn)指標(biāo)，根據(jù)方中各藥味有效成分的理化性質(zhì)，采用正交試驗(yàn)對(duì)肺熱清解口服液中總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選。

1 材料與儀器

UV1102型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司），HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。蘆丁對(duì)照品（購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：20070318）；實(shí)驗(yàn)所用中藥材均購(gòu)于廣州致信中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定均符合《中國(guó)藥典》2005版一部收載品種有關(guān)規(guī)定；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品10.8mg，置100mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液（每mL含蘆丁對(duì)照品0.108mg）。

2.2 供試品溶液的制備

本處方中的中藥材粉碎后過(guò)60目篩，加水，置燒杯中浸泡半小時(shí)，水浴，加熱，提取2次，過(guò)濾，合并濾液，低溫濃縮至約80mL，濃縮液，加95%乙醇，調(diào)節(jié)含醇量，靜沉48小時(shí)，取上清液回收乙醇，得濃縮液作為供試品溶液。本實(shí)驗(yàn)以水為溶媒，加水量、水浴溫度、時(shí)間、濃縮液中的含醇量均要以提取工藝不同而異，具體見(jiàn)后面考查的因素和水平表。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

按中國(guó)藥典2005版第一部附錄中規(guī)定方法，對(duì)供試品溶液和對(duì)照品貯備液稀釋液分別在358.5nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度用于紫外法。取2.1項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液檢測(cè)最大吸收波長(zhǎng)，對(duì)照品蘆丁在紫外光區(qū)間有二個(gè)吸收峰，其中358.5nm處的吸收峰最平緩；鑒于該峰為黃酮類的特征吸收峰，故紫外分光光度法選擇358.5nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸收蘆丁對(duì)照品貯備液0.00mL，0.50mL，1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，以第一瓶做空白在選定的358.5nm處測(cè)定吸光度。測(cè)得的5個(gè)吸光度值分別為0.115、0.234、0.480、0.734和0.968。以濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行一元線性回歸，得到回歸方程：A=22.583C-0.005，蘆丁在0.0054mg·mL～0.0432mg·mL濃度范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9998。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取0.108mg·mL蘆丁對(duì)照品溶液5mL，甲醇定容至50mL，在358.5nm條件下測(cè)定吸光度值，連續(xù)測(cè)定5次，得吸收度平均值為0.233。測(cè)定蘆丁對(duì)照品吸光度值的RSD為0.86%。

2.6 穩(wěn)定性考察

取藥材樣品的粗粉，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備紫外分光光度法測(cè)定的供試液，分別于配置后0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h，依紫外分光光度法測(cè)定吸光度，結(jié)果表明，供試液的吸光度在6h內(nèi)不發(fā)生變化，RSD=0.65%。2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的藥材樣品6份，按“2.2”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”后依紫外分光光度法在358.5nm處測(cè)定，記錄吸光度值，計(jì)算總黃酮含量為2.15mg·g，RSD為3.3%。

2.8 加樣回收率

精密稱取蘆丁對(duì)照品10.8mg，甲醇定容至100mL，備用。另取9份已知含量的肺熱清解口服液供試品溶液，分別精密加入蘆丁對(duì)照品溶液1mL（0.108mg·mL），按含量測(cè)定方法制備，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定，由回歸方程計(jì)算出回收率。得出平均回收率RSD=0.35%。

3 提取工藝的正交試驗(yàn)

3.1 正交設(shè)計(jì)

為系統(tǒng)考察提取的工藝參數(shù)，根據(jù)已有的資料及實(shí)際情況，選用加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、醇沉濃度（D）作為考察因素，以測(cè)得的總黃酮含量為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交表設(shè)計(jì)[1]。因素水平詳見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平表

3.2 實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

取竹黃、川貝母、桑白皮、蘆根、野菊花、地龍干、車(chē)前子、冬瓜仁、瓜蔞皮、甘草十味藥材，粉碎，按處方調(diào)配9份樣品，按表5設(shè)計(jì)的工藝條件進(jìn)行水浴提取，依供試品的制備方法得到供試品溶液，按含量測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定，依照回歸方程計(jì)算出總黃酮含量。

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

按上述實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交試驗(yàn)得到9份供試品溶液，按紫外分光光度法，以蘆丁為對(duì)照品，測(cè)定并計(jì)算出供試品溶液的總黃酮含量，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

以總黃酮為考察指標(biāo)，比較表6中各因素的極差R，可以認(rèn)為各因素對(duì)提取總黃酮類化合物的影響大小順序?yàn)锳＞C＞B＞D，因素A的極差最大，D的最小，再?gòu)母饕蛩厮絹?lái)看（K值分析），對(duì)于總黃酮含量的影響來(lái)看，A因素為K3＞K2＞K1，B因素為K1＞K2＞K3，C因素為K1＞K3＞K2，D因素為K2＞K1＞K3，根據(jù)以上直觀分析結(jié)果，肺熱清解口服液的水提工藝條件以A3B1C1D2為宜，即以加水量為10倍，提取時(shí)間為1小時(shí)，提取溫度80℃，含醇量為70%為最佳提取條件。為考慮到實(shí)際生產(chǎn)的效率和成本，所以有必要對(duì)各因素下水平的顯著性進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果表明，因素A（加水量）、B（提取時(shí)間）和C（提取溫度）的影響具有顯著性差異，D（含醇量）的影響沒(méi)有顯著性差異。

表2 肺熱清解口服液提取條件正交設(shè)計(jì)與結(jié)果表（總黃酮）

表3 總黃酮含量方差分析結(jié)果

3.4 優(yōu)選工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選的工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮的含量分別為2.22mg·mL、2.17mg·mL、2.22mg·mL，RSD為1.33%，測(cè)得值均優(yōu)于正交表中的試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為驗(yàn)證結(jié)果較為滿意，表明該工藝穩(wěn)定可行。因此，確認(rèn)肺熱清解口服液的水提醇沉最佳工藝條件為：加10倍水，提取時(shí)間1小時(shí)，提取溫度為80℃，含醇量為70%。

4 討論

在肺熱清解口服液的處方中，桑白皮為主藥，有效成分主要為黃酮類化合物，處方中還有其它組成也含有黃酮，故選擇總黃酮作為考查指標(biāo)。根據(jù)黃酮的理化性質(zhì)，黃酮的極性較大，易溶于水、甲醇、乙醇等溶劑，從考慮經(jīng)濟(jì)和安全、環(huán)保因素考慮，選用水作為溶劑；處方中，蘆根主要有效成分為多糖類，瓜蔞皮的總氨基酸有良好的祛痰效果，竹黃中具有抗菌作用的竹黃菌甲素、乙素，工藝中采取先水提再醇沉得方法可將有效成分充分保留，且提取之前應(yīng)進(jìn)行粗粉碎，以利于有效成分的溶出。

提取方法的選擇：研究加水量、提取時(shí)間、提取溫度及含醇量等因素對(duì)肺熱清解口服液黃酮提取工藝的影響，結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到肺熱清解口服液中黃酮的最佳提取條件，即以加水量為10倍，提取時(shí)間為1小時(shí)，提取溫度80℃，含醇量為70%，吸光度值較穩(wěn)定以水浴加熱提取2次，合并濃縮濾液制得。

黃酮類化合物含量測(cè)定方法有比色法，紫外分光光度法等。采用硝酸鋁（氯化鋁）比色法來(lái)測(cè)定蘆丁的含量，黃酮類化合物包含許多物質(zhì)，其在紫外區(qū)間的吸光度并不一樣，加入顯色劑，在堿性條件下，利用其與黃酮形成紅色螯合物，在510nm形成新的吸收峰，從而得到待測(cè)物質(zhì)的黃酮含量，但該法的測(cè)定易受雜質(zhì)干擾，定量誤差大[2，3]，本文嘗試采用紫外分光光度法測(cè)定蘆丁的含量，直接測(cè)定法是依據(jù)黃酮自身結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，不使用顯色劑，直接在I帶的最大吸收波長(zhǎng)358.5nm作為紫外分光光度法的測(cè)定波長(zhǎng)特征吸收峰處對(duì)供試樣進(jìn)行測(cè)定，從而能夠避免復(fù)方中萜類化合物酚羥基的干擾，黃酮類為肺熱清解口服液中重要的活性物質(zhì)，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于控制肺熱清解口服液的質(zhì)量。

[1] 陸彬，吳偉.中心多點(diǎn)等距設(shè)計(jì)優(yōu)化醋酸地塞米松聚丙交酯微球的制備工藝[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1999；34（5）：387.

[2] 鄧勝國(guó)，鄧澤元，范亞葦.紫外分光光度法測(cè)定荷葉總黃酮含量[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（理科版），2008，2（32）：148-150.

[3] 鄧斌，蔣剛彪，黃紅英，等.分光光度法測(cè)定夏枯草中總黃酮含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，7（19）：1608-1609.

R283.3

A

1007-8517（2010）08-054-2

本論文研究?jī)?nèi)容來(lái)源于中山市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)為：2009078。

劉佩沂，主管中藥師，研究方向：中藥學(xué)。

田素英，副教授，碩士，研究方向：中藥的應(yīng)用及開(kāi)發(fā)。