寧波地區(qū)草莓炭疽病菌株分離和生物學(xué)特性研究

姚紅燕，張 慶，張松柏

(1.浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040;2.寧波市農(nóng)技推廣總站，浙江 寧波 315040)

草莓種植在寧波特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中占有重要的地位，2005－2006年全市種植面積已達(dá)0.15萬hm2，產(chǎn)值達(dá)到2.5億多元。同時(shí)，通過速凍、脫水和制作草莓醬等等深加工技術(shù)，草莓產(chǎn)品正成為寧波市重要出口加工農(nóng)產(chǎn)品之一，不但進(jìn)一步提升了產(chǎn)品的附加值，還為農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)民增收作出了較大貢獻(xiàn)。但是，目前寧波市草莓夏秋季育苗中苗期炭疽病的發(fā)生十分普遍，對(duì)秧苗素質(zhì)和繁殖能力造成了嚴(yán)重影響，特別是正在推廣的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)新品種紅頰發(fā)病尤其嚴(yán)重，已成為品種推廣的主要制約因子。為探明寧波草莓炭疽病的病原類型和發(fā)生特點(diǎn)，提高病害防治技術(shù)水平，我們對(duì)寧波主要基地草莓炭疽病病株進(jìn)行了病原菌分離與鑒定，并對(duì)優(yōu)勢菌株膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性開展了研究?，F(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

草莓炭疽病病株采自寧波奉化尚田鎮(zhèn)、鄞州下應(yīng)鎮(zhèn)、鄞州邱隘鎮(zhèn)和慈溪滸山鎮(zhèn)草莓基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離

組織分離法:從田間病株樣本中選取不同發(fā)病部位的典型病斑組織，在病健交界處取樣。葉片樣品剪取5 mm×5 mm左右的小塊，匍匐莖和根莖處切成0.5 cm左右小段，根部剖開后取開始褐變的組織切成同樣長度的小段。采用0.1%升汞進(jìn)行表面滅菌，處理時(shí)間2～3 min，之后用滅菌水洗3次，每次1 min，置于25℃下，于PDA培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)。

冷凍分離法:選取健康、無病斑和物理損傷的植物組織，放在塑料袋中，敞口置于－20℃冰箱內(nèi)，冷凍 1.5～2 h后取出，在含 Tween 20的0.525%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min表面滅菌，期間搖動(dòng)數(shù)次。之后用滅菌水充分洗滌3次，每次1 min左右，待組織上的水分晾干后，置于以滅菌濾紙保濕的托盤中，用保鮮膜密封，23～25℃持續(xù)熒光光照培養(yǎng)，3～7 d可產(chǎn)生炭疽的分生孢子團(tuán)，在實(shí)體顯微鏡下用滅菌的撥針挑取孢子移入改進(jìn)后的炭疽選擇性培養(yǎng)基 (CIM)上，在25℃下黑暗培養(yǎng)。

1.2.2 光照對(duì)菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌餅，移入15 mL PDA平板上，25℃下，分別置于24 h光照、12 h、12 h光暗交替和24 h黑暗3種光照處理下培養(yǎng)，各處理重復(fù)3次，7 d后測量菌落直徑，每皿加10 mL無菌水沖洗下平板中的孢子，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。將洗下的孢子稀釋到10×10倍鏡下30個(gè)左右·視野－1后滴到載玻片上2滴，分別置于上述光照條件下，25℃培養(yǎng)，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 溫度對(duì)菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌餅，移入15 mL PDA平板上，分別置于10，15，20，25，30，35，40℃的恒溫培養(yǎng)箱，黑暗條件下培養(yǎng)，設(shè)3次重復(fù)，7 d后測量菌落直徑，每皿加10 mL無菌水沖洗下平板中的孢子，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。孢子萌發(fā)率計(jì)數(shù)方法同上。

1.2.4 pH值對(duì)菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

用磷酸鹽緩沖液配制培養(yǎng)基，然后用1 mol·L－1NaOH 和 1 mol·L－1HCL 調(diào)節(jié) PDA 培養(yǎng)基的pH值為5，6，7，8，9，10，11等6個(gè)梯度，分別制成15 mL PDA平板。移入直徑0.5 cm的菌餅，于25℃下黑暗培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑，每皿加10 mL無菌水沖洗下平板中的孢子，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。孢子萌發(fā)率計(jì)數(shù)方法同上。

1.2.5 病菌分生孢子致死溫度測定

每支滅菌試管中注入3 mL配制好的孢子懸浮液，每個(gè)處理3次重復(fù)，分別置于45，50，55，60℃的恒溫水浴鍋內(nèi)，處理5，10和15 min后取出，迅速放入冷水中冷卻。再置于PDA培養(yǎng)基上，于25℃、黑暗中培養(yǎng)3 d，以未處理的孢子懸浮液作對(duì)照。

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株的分離與鑒定

采用2種方法對(duì)4地具典型發(fā)病癥狀的病株樣本進(jìn)行分離后發(fā)現(xiàn)，從莖、葉部分離到的病菌有:炭疽病菌 (Colletotrichumsp.)、擬莖點(diǎn)霉(Dendrophoma obscurans)、鐮刀菌 (Fusariumsp.)、鏈隔孢 (Altemariasp.)和一種未知菌。從根部分離到的病菌有:炭疽病菌 (Colletotrichumsp.)、鐮刀菌 (Fusariumsp.)和一種未知菌 (表1)。

表1 各地病株樣品的病菌分離結(jié)果

對(duì)分離到的炭疽病菌進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)，通過分生孢子大小、性狀和菌落特性等鑒定，確定其中5個(gè)為草莓炭疽菌 (Colletotrichum fragariae)，8個(gè)為膠孢炭疽菌［Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)］。

草莓炭疽菌的特征:菌落白色至灰白色，氣生菌絲平坦，剛毛有或無。分生孢子倒卵形，無色，單胞大小14.6～20.5(17.0)μm×5.2～6.9(6.1)μm，不易產(chǎn)生有形態(tài)，一般無子囊殼。

膠孢炭疽菌的特征:菌落灰白色至深灰色，氣生菌絲平坦，絮狀，菌落隨菌齡增長背面呈不均勻白色至灰色至黑色，剛毛有或無。分生孢子柱形，兩端鈍圓，無色，單孢大小13.8～18.7(16.3)μm×5.6～7.9(6.8)μm，有2個(gè)油球，易產(chǎn)生有形態(tài)，有子囊殼。

2.2 光照對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

3種光照處理下膠孢炭疽菌的菌絲生長量、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率比較結(jié)果顯示，在全暗光培養(yǎng)的條件下菌絲生長量、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均達(dá)到最大值。且其中的菌絲生長量和孢子萌發(fā)率與全光照、光暗交替處理間均存在顯著性差異;產(chǎn)孢量與全光照處理間存在顯著性差異，與光暗交替處理間不存在顯著性差異 (圖1、2、3)?？梢娙倒馀囵B(yǎng)對(duì)菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)有利，尤其是對(duì)產(chǎn)孢量影響最大。

圖1 光照對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長的影響

圖2 光照對(duì)膠孢炭疽菌產(chǎn)孢數(shù)量的影響

2.3 溫度對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

溫度對(duì)菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響表現(xiàn)不太一致。菌絲生長量在25℃時(shí)表現(xiàn)最大值，且與其它處理間存在顯著性差異 (圖4);產(chǎn)孢量在30℃時(shí)表現(xiàn)最大值，其次是25℃，但兩者間不存在顯著性差異，10℃、40℃和45℃時(shí)幾乎沒有孢子產(chǎn)生 (圖5);孢子萌發(fā)率在25℃時(shí)達(dá)到最大值，其次是20℃，但兩者間不存在顯著性差異，其余處理的孢子萌發(fā)率均很低，45℃時(shí)沒有孢子萌發(fā) (圖6)?？偟恼f來，20～30℃是最適宜菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的溫度區(qū)間;25℃最適宜菌絲生長和孢子萌發(fā)，30℃最適宜產(chǎn)孢。

圖3 光照對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響

圖4 溫度對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長的影響

圖5 溫度對(duì)膠孢炭疽菌產(chǎn)孢數(shù)量的影響

圖6 溫度對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響

2.4 pH值對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

pH值對(duì)菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響表現(xiàn)也不一致。菌絲在pH值5～11范圍內(nèi)均可生長，pH值為7時(shí)表現(xiàn)最大值，與其余處理間存在顯著性差異，pH值11時(shí)生長最差 (圖7);產(chǎn)孢量在pH值9與10時(shí)最大，pH值11時(shí)最小 (圖8);孢子萌發(fā)率在pH值9時(shí)最大值，與其余處理間存在顯著性差異，其次是 pH值10(圖9)?？偟膩碚f，pH值中性條件有利于菌絲生長，而產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)適宜偏堿的條件。

圖7 pH值對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長的影響

圖8 pH值對(duì)膠孢炭疽菌產(chǎn)孢數(shù)量的影響

圖9 pH值對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響

2.5 膠孢炭疽菌分生孢子致死溫度測定

膠孢炭疽菌的分生孢子在45℃處理5 min和10 min后均能萌發(fā)，而在45℃處理15 min后不能萌發(fā)。所以分生孢子致死溫度為45℃處理15 min。

3 小結(jié)與討論

草莓炭疽病的病原菌有3種:草莓炭疽菌(Colletotrichumfragariae)、膠 孢 炭 疽 菌［Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)］和尖孢炭疽菌 (Colletotrichum acutatum)。通過對(duì)來自4個(gè)草莓產(chǎn)區(qū)的80個(gè)樣品的分離、鑒定，共分離到草莓炭疽菌5個(gè)，膠孢炭疽菌8個(gè)，未發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽菌。研究中還發(fā)現(xiàn)，即使癥狀明顯的組織，也未必能分離到炭疽病菌;在發(fā)病葉片上分離到擬莖點(diǎn)霉菌較多，田間易把此菌引起的葉斑病癥狀誤認(rèn)為炭疽病的病斑;根部的樣品中分離到大量的鐮刀菌，所以，草莓苗期的根部病害防治也是至關(guān)重要的。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膠孢炭疽菌在10～45℃范圍內(nèi)均可生長，這與雷百戰(zhàn)對(duì)葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioide)的研究結(jié)果基本一致［1］，其菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的的適宜溫度分別為25℃、30℃和25℃;對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣，生長的最適pH值為7，產(chǎn)孢的最適pH值為9，孢子萌發(fā)的最適pH值是9，可見中性利于菌絲生長，偏堿性利于產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)，此結(jié)果與岑貞陸等［2－3］對(duì)大青棗及荔枝炭疽病菌的研究結(jié)果略有不同;黑暗對(duì)菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)均有利。

致死溫度測試結(jié)果顯示，膠孢炭疽菌分生孢子的致死溫度為45℃處理15 min，比張海英等［4］的研究數(shù)據(jù)略低。

［1］雷百戰(zhàn)，李國英.新疆葡萄炭疽病病原的鑒定及其生物學(xué)特性的研究 ［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22(4):298－300.

［2］岑貞陸，謝鈴，黃思良.大青棗炭疽病的病原鑒定及其生物學(xué)特性研究 ［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)通報(bào)，2002，18(3):48－50.

［3］劉愛媛.荔枝炭疽病菌生物學(xué)特性的研究 ［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2003(4):313－316.

［4］張海英，張明會(huì)，劉志恒.草莓炭疽病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究 ［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(3):317－321.