應(yīng)用SYBR green I熒光PCR研究GSTM1基因多態(tài)性與肺癌遺傳易感性之間的相關(guān)性

鄭德杰 滑峰 梅朝蓉 萬海粟 周清華

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，也是我國增長最快的惡性腫瘤[1]。流行病學(xué)研究[2]證實吸煙是導(dǎo)致肺癌的重要原因，但只有不到20%的吸煙者發(fā)生肺癌，同時肺癌的家族聚集現(xiàn)象提示個體的遺傳易感性在肺癌發(fā)生中有重要作用。

谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶M1（glutathione S-transferase M1,GSTM1）是體內(nèi)參與多種致癌物代謝的II相代謝酶，研究[3,4]發(fā)現(xiàn)GSTM1與肺癌的遺傳易感性有關(guān)。SYBR green I染料實時熒光定量PCR技術(shù)是一種便捷、靈敏、特異和適用性廣的基因分型、基因表達(dá)的檢測方法，在基因鑒別、基因表達(dá)和基因分型實驗中應(yīng)用范圍不斷增多[5]。與傳統(tǒng)PCR方法相比，該方法具有操作簡便、污染少、高通量的特點。目前國內(nèi)關(guān)于GSTM1基因多態(tài)性與肺癌關(guān)系的研究多采用普通PCR法，本實驗采用SYBR green I染料法實時PCR結(jié)合熔解曲線分析方法研究天津地區(qū)人群GSTM1基因型分布，并研究GSTM1基因與肺癌遺傳易感性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究共納入肺癌患者265例，為2008年3月-2009年7月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院胸部腫瘤中心住院，并經(jīng)外科手術(shù)和病理檢查確診的肺癌患者。男性病例190例，女性病例75例，平均年齡60歲；其中，鱗癌120例，腺癌99例，小細(xì)胞肺癌23例，其它（大細(xì)胞癌、腺鱗癌等）23例。307例對照人群為同期于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院健康體檢中心常規(guī)體檢人群，男性218例，女性89例，平均年齡60歲，無呼吸系統(tǒng)疾病及肺癌家族史。本研究肺癌患者和對照人群一般資料見表1。

表 1 肺癌組和對照組一般資料Tab 1 Demographic characteristics of lung cancer cases and controls

1.2 流行病學(xué)調(diào)查 制定統(tǒng)一流行病學(xué)調(diào)查量表，內(nèi)容包括：一般人口學(xué)特征、吸煙、飲酒、職業(yè)，以及既往疾病史、腫瘤及呼吸系統(tǒng)家族史等。吸煙者定義為每天至少吸一支煙，持續(xù)半年以上者。

1.3 樣本采集 分別采集肺癌患者術(shù)前和對照組外周靜脈血3 mL，EDTA抗凝，-80oC冰箱保存。

1.4 DNA提取 采用Axygen外周血DNA提取試劑盒（Axygen Biosciences公司）手工提取人基因組DNA，提取步驟按操作說明書進(jìn)行，提取的DNA保存于-20oC冰箱。

1.5 GSTM1基因型檢測和結(jié)果判斷

1.5.1 GSTM1基因型檢測 GSTM1基因型檢測方法采用SYBR green I 實時熒光PCR方法。引物由賽百盛公司合成。GSTM1上游引物：5'-GAACTCCCTGAAAAGCTAA AGC-3'；下游引物：5'-GTTGGGCTCAAATATACGGTG G-3'。內(nèi)對照β-globin上游引物：5'-CAACTTCATCCACG TTCACC-3'；下游引物：5'-GAAGAGCCAAGGACAGGT AC-3'。SYBR?R Premix Ex TaqTM試劑盒購自大連寶生物公司。反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中模板DNA 2 μL（100 ng），GSTM1、β-globin每種上下游引物各0.5 μL，SYBR?R Premix Ex TaqTM(2X) 10 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL；以ddH2O替代模板作為陰性對照。反應(yīng)在美國ABI公司7500 Real Time PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件按說明書兩步法PCR標(biāo)準(zhǔn)擴增程序進(jìn)行：95oC變性10 s；95oC、5 s，60oC、34 s，40個循環(huán)；然后進(jìn)入熔解曲線分析階段。

1.5.2 基因型判斷 根據(jù)PCR產(chǎn)物熔解曲線分析判斷GSTM1基因的基因型。熔解曲線中分別在82.2oC±0.2oC和86.0oC±0.2oC分別出現(xiàn)兩個峰判斷為GSTM1（+）基因型，只在86.0oC±0.2oC出現(xiàn)一個峰判斷為GSTM1（-）基因型。選取10%實時熒光PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，比較其與熔解曲線的一致性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。配對t檢驗比較病例組和對照組間性別、年齡；χ2檢驗比較兩組間吸煙情況及不同基因型在兩組間的頻率分布；非條件Logistic回歸分析計算OR和95%CI以估計不同基因型與肺癌風(fēng)險之間的相關(guān)性，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料統(tǒng)計結(jié)果 肺癌組和對照組年齡和性別比例無統(tǒng)計學(xué)差異，肺癌組吸煙者比例高于對照組（67.2%和45.9%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=86.87,P＜0.05）。

2.2 熔解曲線特異性分析 本研究在熔解曲線分析的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行實時熒光PCR產(chǎn)物的電泳分析，結(jié)果顯示該實驗具有優(yōu)良的特異性。SYBR green I實時熒光PCR熔解曲線分析檢測GSTM1基因分析結(jié)果見圖1，實時熒光PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖2。

圖 1 SYBR greenⅠ實時熒光PCR方法檢測GSTM1熔解曲線峰圖Fig 1 Realtime PCR assay with SYBR green I and melting curve analysis of GSTM1 gene. A: Differentiation of GSTM1, β-globin and negative controls by performing melting curve analysis; B: The present genotype of GSTM1 gene gives one peak with an average melting point of 86.0 oC (β-globin)and another with an average melting point of 82.2 oC (GSTM1); C: the null genotype of GSTM1 gene only gives a single melting point at 86.0 oC(β-globin).

2.3 GSTM1基因型分布及其與肺癌風(fēng)險性的關(guān)系 本研究中肺癌組與對照組GSTM1基因型分布頻率無明顯差異，GSTM1（-）基因型在肺癌組和對照組中的分布頻率分別為56.6%和57.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.831,P=0.362）。以攜帶GSTM1（+）基因型的個體為參照，攜帶GSTM1（-）的個體患肺癌的風(fēng)險性未見增加（OR=0.840, 95%CI: 0.578-1.221, P=0.362）（表2）。

2.4 GSTM1基因型與肺癌病理類型之間的關(guān)系 GSTM1基因型與肺癌病理類型之間的關(guān)系見表3。120例鱗癌、99例腺癌、23例小細(xì)胞肺癌及23例其它類型肺癌中GSTM1（-）基因型所占比例分別為65.8%、48.5%、47.8%和52.2%，各組與對照組GSTM1（-）基因型百分比（57.0%）相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各不同病理類型肺癌發(fā)生肺癌的危險性與對照組相比無差別（P＞0.05）。

3 討論

大規(guī)模流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肺癌受吸煙、環(huán)境及遺傳等多因素的共同影響。GSTM1基因是GSTs家族的一員，其編碼的GST-μ蛋白能催化體內(nèi)PAH類化合物失活而失去致突變性。GSTM1基因缺失者因無編碼蛋白產(chǎn)生而導(dǎo)致對特定致癌物解毒能力下降，因此GSTM1（-）基因型可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)[6]。

圖 2 SYBR green I實時熒光PCR方法檢測GSTM1擴增產(chǎn)物電泳圖Fig 2 Agarose gel electrophoresis graph of the SYBR green I Realtime PCR assay products

SYBR green I實時熒光PCR方廣泛檢測DNA的相對定量和絕對定量試驗，具有迅速、靈敏、特異、能實現(xiàn)高通量的特點。Tiwawech等[7]建立了SYBR green I時熒光PCR結(jié)合熔解曲線分析檢測泰國人群鼻咽癌患者GSTM1基因多態(tài)性的方法，與傳統(tǒng)PCR方法分型相比結(jié)果完全一致。國內(nèi)李一榮等[8]應(yīng)用該方法檢測120例HLA-B27已知基因型的標(biāo)本并與傳統(tǒng)PCR方法比較，二者分型結(jié)果完全一致。本實驗中亦采用SYBR green I時熒光PCR結(jié)合熔解曲線分析方法研究天津地區(qū)漢族人群GSTM1基因多態(tài)，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步驗證熒光PCR反應(yīng)結(jié)果，結(jié)果顯示該方法具有優(yōu)良的特異性和敏感性。本研究中肺癌組和對照組GSTM1（-）基因型頻率分別為56.6%和57.0%，與國內(nèi)文獻(xiàn)報道[9,10]結(jié)果相一致。

關(guān)于GSTM1（-）與肺癌風(fēng)險性的關(guān)系研究[11,12]，結(jié)論并不一致。Benhamou等[13]進(jìn)行的一項總?cè)藬?shù)超過18 000例、包含高加索人群和亞洲人群的meta分析結(jié)果表明單一GSTM1（-）基因型并不增加肺癌風(fēng)險（OR=1.08,95%CI: 0.98-1.18）。國內(nèi)蘇艷華等[14]入選8篇文獻(xiàn)的meta分析認(rèn)為GSTM1（-）基因型增加患肺癌的風(fēng)險性（OR=1.65, 95%CI: 1.26-2.15）。錢碧蕓等[15]進(jìn)行一項天津市居民病例對照研究分析了108例肺癌患者和108例健康對照者GSTM1基因多態(tài)與肺癌易感性之間的關(guān)系，結(jié)果顯示GSTM1（-）基因型攜帶者肺癌風(fēng)險增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=1.84, 95%CI: 1.03-3.29, P＜0.05），而曾勉等[16]對廣東籍的91例肺癌患者和91例對照的研究顯示GSTM1（-）基因型攜帶者并不增加患肺癌危險（OR=1.26, 95%CI: 0.69-2.30）。本實驗中研究了天津地區(qū)265例肺癌患者和307例健康體檢者，結(jié)果顯示GSTM1（-）基因型不增加肺癌風(fēng)險性（OR=0.840, 95%CI:0.578-1.221, P=0.362），出現(xiàn)不同結(jié)果可能與樣本量、不同地區(qū)人群差異等因素有關(guān)。

表 2 肺癌組和對照組GSTM1基因型分布及與肺癌易感性之間的關(guān)系Tab 2 Distribution of GSTM1 genotype and association with lung cancer risk

表 3 GSTM1基因型與肺癌病理類型之間的關(guān)系Tab 3 Association between GSTM1 genotype and lung cancer histological types

一項包括1 971例肺癌病例和2 130例的關(guān)于亞洲人群的的匯總分析[17]結(jié)果顯示，GSTM1（-）基因型增加了患肺鱗癌的風(fēng)險（OR=1.36, 95%CI: 1.05-1.77）。本實驗中，與GSTM1（-）基因型與肺癌關(guān)系總體結(jié)果相一致，分層分析GSTM1（-）基因型的各型肺癌患者患癌危險性均未見增加。

惡性腫瘤的發(fā)生是受多因素長期影響的發(fā)展階段，單一基因發(fā)生變化在起惡性腫瘤的發(fā)生中作用有限，我們的研究結(jié)果顯示單一GSTM1（-）基因改變與肺癌危險性無關(guān)，需要進(jìn)一步大樣本量驗證及研究GSTM1與其它基因的之間的相互作用。