長(zhǎng)期吸煙對(duì)肺癌組織TGF-β1、VEGF-C表達(dá)的影響及臨床意義

劉 濤，李若葆

肺癌，又稱(chēng)原發(fā)性支氣管肺癌，腫瘤細(xì)胞起源于支氣管黏膜或腺體，是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。肺癌的病因復(fù)雜，目前越來(lái)越多的研究者從基因水平研究吸煙與肺癌的關(guān)系，對(duì)肺癌的早期診斷、治療及改善預(yù)后具有重要意義，其中TGF-β1、VEGF-C是研究的熱點(diǎn)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（TGF-β1），是 Tuker等于 1984年發(fā)現(xiàn)的一種與多種上皮性腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)的多肽性負(fù)性細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控因子。近年研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在肺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后起著非常重要的作用。肺癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移依賴(lài)腫瘤相關(guān)血管、淋巴管提供營(yíng)養(yǎng)和轉(zhuǎn)移通道。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGF-C）是迄今為止唯一能特異地作用于血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子A，通過(guò)與血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的高親和力的酪氨酸受體 VEGFR-2（KDR）和VEGFR-3（flt-4）結(jié)合，誘導(dǎo)血管及淋巴管增生，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)TGF-β1、VEGF-C在肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義的研究很多，而吸煙對(duì)肺癌組織中TGF-β1、VEGFC表達(dá)的影響及臨床意義的研究較少。本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)研究長(zhǎng)期吸煙和非長(zhǎng)期吸煙肺癌患者癌組織、癌旁組織及周邊“正常”組織結(jié)構(gòu)差異及TGF-β1和VEGF-C表達(dá)的差異，探討長(zhǎng)期吸煙對(duì)肺癌組織及周邊組織TGF-β1、VEGF-C表達(dá)的影響及臨床意義。旨為臨床上吸煙者肺癌的早期診斷提供理論依據(jù)，將對(duì)肺癌的早期診斷、指導(dǎo)治療以及預(yù)后產(chǎn)生積極的作用。

表 1 TGFβ1、VEGF-C在肺癌組織以及周邊組織中表達(dá)情況

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 取濰坊市第二人民醫(yī)院病理科2006-01～2007-12行手術(shù)治療并經(jīng)病理確診為肺癌的蠟塊，其中吸煙組98份，非吸煙組30份。所有病例臨床資料完整，吸煙史明確，按WHO(1984)關(guān)于吸煙調(diào)查方法標(biāo)準(zhǔn)建議：每天吸煙1支以上，時(shí)間長(zhǎng)于1年者為吸煙。吸煙量1～9支/d為輕度，10～19支/d為中度，20支以上為重度，部分病歷中每日吸煙量（支）的記錄，僅有吸煙年限，吸煙年限雖不能精確地計(jì)算出吸入量，但吸煙時(shí)間的長(zhǎng)短亦在一定程度上反映出其吸煙量及受煙霧刺激的多少，故將其吸煙年限<10年者定為輕度，11～19年為中度，20年以上為重度。本研究中所指的長(zhǎng)期吸煙是指吸煙年限在20年以上、吸煙支數(shù)在20支/d以上。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或其它針對(duì)腫瘤的治療。吸煙組男78份，女20份；非吸煙組男21份，女9份；年齡35～74歲，中位數(shù)年齡為57歲。依據(jù)1981年WHO《肺腫瘤組織學(xué)分型》制定的標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)：吸煙組鱗癌43份，腺癌38份，鱗腺癌9份，小細(xì)胞癌8份；非吸煙組鱗癌11份，腺癌9份，鱗腺癌5份，小細(xì)胞癌5份。按2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）修訂的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期：吸煙組I期、Ⅱ期52份，Ⅲ期、Ⅳ期46份；非吸煙組I期、Ⅱ期11份，Ⅲ期、Ⅳ期19份。分化程度：吸煙組高分化程度18份，中等分化63份，低分化程度17份；非吸煙組高分化7份，中等分化12份，低分化11份。吸煙組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者51份，無(wú)轉(zhuǎn)移47份，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移31份，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移67份；非吸煙組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18份，無(wú)轉(zhuǎn)移12份，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移13份，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移17份。所取組織塊用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水透明，浸蠟包埋、切片，分別進(jìn)行 TGF-β1、VEGF-C 和蘇木素-伊紅染色（HE染色）。

1.2 試劑 PV-9000二步法免疫組化染色試劑盒、兔抗人TGF-β1多克隆抗體、兔抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C單克隆抗體、濃縮型DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 選取術(shù)后經(jīng)病理確診為肺癌蠟塊，進(jìn)行連續(xù)5 μm切片，防脫片處理后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，PV-9000二步法步驟按試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 免疫組化結(jié)果分析 TGFβ1、VEGF-C陽(yáng)性染色均為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞漿。TGFβ1、VEGFC陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：每份標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為表達(dá)陰性（-）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～20%為表達(dá)陽(yáng)性（+）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>20%為表達(dá)陽(yáng)性 （++）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%為表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，定性資料與各臨床指標(biāo)之間的關(guān)系行χ2檢驗(yàn)，以及Speannan等級(jí)相關(guān)等方法。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1、VEGF-C組間陽(yáng)性表達(dá)的比較 TGF-β1、VEGF-C均表達(dá)于細(xì)胞漿，陽(yáng)性呈棕黃色顆粒狀（圖1～4）。在吸煙組以及非吸煙組肺癌組織中TGF-β1和VEGF-C均呈現(xiàn)高表達(dá)，但兩組間無(wú)顯著性差異，又都明顯高于癌旁組織及周邊組織（P<0.05）；吸煙組癌旁組織TGF-β1與VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)與非吸煙組癌旁組織TGF-β1與VEGF的陽(yáng)性表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P<0.05）；吸煙組周邊組織TGF-β1、VEGF-C表達(dá)高于非吸煙組“正常”組織（P<0.05）；吸煙組癌旁組織TGF-β1和VEGF-C表達(dá)明顯高于周邊 “正?！苯M織 （P<0.05）；非吸煙組癌旁組織TGF-β1表達(dá)明顯高于周邊“正常”組織（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 TGF-β1蛋白與VEGF-C在肺癌組織的表達(dá)的相關(guān)關(guān)系 TGF-β1蛋白、VEGF-C在兩組肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯增加，并且與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TGF-β1、VEGF-C過(guò)度表達(dá)可能與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及惡性潛能有關(guān)（P<0.05，表 2、3）。

2.3 吸煙組與非吸煙組兩種因子表達(dá)的相關(guān)性

無(wú)論吸煙組還是非吸煙組肺癌組織中VEGF-C、TGF-β1蛋白表達(dá)均密切相關(guān)（表4），VEGF-C 與TGF-β1蛋白在兩組肺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示TGF-β1可能上調(diào)VEGF-C的表達(dá)。兩者在肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中可能具有協(xié)同作用。

圖 1 吸煙組肺癌組織免疫組化（×200），TGFβ1 陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞漿

圖 2 吸煙組肺癌旁組織免疫組化（×200），TGFβ1 弱陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞漿

圖 3 非吸煙組肺癌組織免疫組化 （×200），VEGF-C 陽(yáng)性 表達(dá)，在細(xì)胞漿呈棕黃色彌漫顆粒

圖 4 非吸煙組肺癌癌旁組織免疫組化（×200），VEGF-C 弱陽(yáng)性表達(dá)于胞漿

表 2 吸煙組肺癌組織TGFβ1、VEGF-C表達(dá)水平與肺癌病理生理特征關(guān)系

表 4 兩組肺癌組織中TGFβ1與VEGF-C表達(dá)的相互關(guān)系

3 討論

吸煙嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康，現(xiàn)在的流行病學(xué)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)已相繼證明，吸煙是肺癌的主要病因。吸煙除了導(dǎo)致肺組織形態(tài)學(xué)改變以外，還可導(dǎo)致基因的改變。TGF-β與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在多種腫瘤中可觀察到TGF-β的高度表達(dá)，在腫瘤生長(zhǎng)的早期，TGF-β通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期從G1期→S期抑制正常細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞發(fā)生。但隨著腫瘤的進(jìn)展，TGF-β在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，表明腫瘤細(xì)胞對(duì)TGF-β生長(zhǎng)抑制作用的反應(yīng)喪失或減弱。不僅抑制了機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，并同時(shí)通過(guò)促進(jìn)腫瘤對(duì)微血管的生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)基質(zhì)，促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中常有TGF-β的增高。Asselin-Paturel等[1]從新鮮腫瘤活檢標(biāo)本中提取mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR處理,發(fā)現(xiàn)所有的NSCLC細(xì)胞中均有TGF-β1mRNA的高表達(dá)。

表 3 非吸煙組肺癌TGFβ1、VEGF-C表達(dá)水平與肺癌病理生理特征關(guān)系

VEGF-C基因是1996年由Joukov等[2]首次從人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3的cDNA文庫(kù)中克隆并分離得到，又稱(chēng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白（VRP），是一種特異性的血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-3（VEGFR-3）結(jié)合后，能誘導(dǎo)血管及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，在腫瘤組織中表達(dá)增加促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。據(jù)Santos等[3]研究顯示肺功能正常的吸煙者和中度慢性阻塞性肺?。–OPD）患者肺動(dòng)脈中VEGF表達(dá)均增高,且在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的程度與血管壁增厚程度相關(guān)。Arinago等[4]對(duì)180例NSCLC患者手術(shù)標(biāo)本的免疫組化研究結(jié)果顯示：VEGF-C和VEGFR-3的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 76．1%和 22．2%；其中腺癌組織中VEGF-C的表達(dá)明顯高于其它病理類(lèi)型；VEGF-C或（和）VEGFR-3陽(yáng)性表達(dá)是影響患者生存期的重要因素，特別是VEGF-C和VEGFR-3同時(shí)陽(yáng)性患者的預(yù)后最差；多因素分析結(jié)果顯示，受體VEGFR-3陽(yáng)性表達(dá)是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。Kojima等[5]對(duì)129例TNM分期的T1期肺腺癌患者的研究結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞中VEGF-C與內(nèi)皮細(xì)胞上VEGFR-3的聯(lián)合表達(dá)，是影響T1期肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。本研究也顯示，吸煙組癌旁組織、周邊“正?！苯M織 TGF-β1、VEGF-C 陽(yáng)性表達(dá)均顯著高于非吸煙組癌旁組織、周邊“正?！苯M織 TGF-β、VEGF-C 的表達(dá)（P<0.05）；吸煙組和非吸煙組癌旁組織TGF-β1表達(dá)明顯高于周邊“正常”組織（P<0.05）。吸煙組VEGF-C表達(dá)在癌旁組織明顯高于周邊“正?！苯M織（P<0.05），而在非吸煙組VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)在癌旁組織與“正?！苯M織無(wú)顯著性差別（P＞0.05）。提示吸煙導(dǎo)致肺組織早期損傷。

VEGF-C一方面可以通過(guò)一系列復(fù)雜的機(jī)制誘導(dǎo)血管的形成，從而促使腫瘤體積增大，并使腫瘤邊緣部分的瘤細(xì)胞與淋巴管的接觸增多，或通過(guò)靜脈-淋巴管吻合處，使血液進(jìn)入淋巴管；另一方面，它還能增加微血管的通透性，并能誘導(dǎo)新生淋巴導(dǎo)管的形成，從而促使腫瘤細(xì)胞的淋巴管轉(zhuǎn)移[6]。研究顯示，VEGF-C和TGF-β1的表達(dá)呈正相關(guān)，表明TGF-β1刺激腫瘤血管生成的作用是通過(guò)旁分泌途徑誘導(dǎo)VEGF-C的表達(dá)，間接地刺激腫瘤血管的生成，同時(shí)VEGF-C對(duì)TGF-β1亦有類(lèi)似作用，兩者通過(guò)促血管的生成而共同促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[7]。由此可以推測(cè)，TGF-β1通過(guò)上調(diào)VEGF-C表達(dá)，間接促進(jìn)腫瘤血管生成可能是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一[8，9]。本研究結(jié)果也顯示，在TGF-β1蛋白表達(dá)陽(yáng)性的吸煙肺癌組織中，VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性率為89.2%，在TGF-β1蛋白表達(dá)陽(yáng)性的非吸煙肺癌組織中，VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性率為80%。而在TGF-β1蛋白表達(dá)陰性的吸煙肺癌組織中，VEGF-C表達(dá)率僅為43.3%，在TGF-β1蛋白表達(dá)陰性的非吸煙肺癌組織中，VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性率僅為30.8%，表明TGF-β1蛋白與VEGF-C表達(dá)呈顯著正相關(guān)，即TGF-β1與VEGF-C具有協(xié)同作用。

[1]Asselin-Paturel C,Echchakir H,Carayol G,et al.Quantitative analysis of Th1,Th2 and TGF-beta 1 cytokine expression in tumor,TIL and PBL of non-small cell lung cancer patients.Int J Cancer,1998,77(1)∶7-12.

[2]Joukov V,Pajusola K,Kaipainen A,et al．A novel vascular endothelial growth factor,VEGF-C,is a ligand for the Flt-4(VEGFR-3)and KDR(VEGFR-2)receptor tyrosine kinases[J]．EMBO(Eur Mol Biol Organ)J,1996,15(2)：290-298．

[3]Salud Santos,Victor I.Peinado,JosepRamírez,et al.Enhanced expression of vascular endothelial growth factor in pulmonary arteries of smokers and patients with moderate chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167:1250-1256.

[4]Arinago M,Noguchi T,Takeno S,et a1．Clinical significance of vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with non-smaIl cell lung carcinoma[J]．Cancer,2003,97(2):457-464．

[5]Kojima H,Shijubo N,Yamada G,et a1．Clinical significance of vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with T1 lung adenocarcinoma[J]．Cancer,2005,104(8):1668-1677.

[6]Skobe M,Hawighorst T,Jackson DG,et al.Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis[J].Nat Med,2001,7(2):192-198.

[7]Achen MG,Jeltsch M,Kukk E,et al.Vascular endothelial growth factor-D(VEGF-D)is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor-2(Flk1)and VEGF receptor-3(Flt-4)[J]．Proc Narl Acad Sci USA,1998,95(2):548-553.

[8]Grinnond S,Lagercrantz J,Drinkwater C,et al.Cloning and characterization of a novel hunman gene related to vascular endothelial growth factor[J].Genome Res,1996,6(2):124-131.

[9]Grimmond D,Guerriero V,Viglietto G,et al.Isolation of a human placenta vDNA coding for a protein related to the vascular permeability factor[J].Proc Narl Acad Sci USA,1991,88(20):9267-9271.