復(fù)健片對(duì)大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)Nogo－A表達(dá)的影響

胡懷強(qiáng)，周永紅，馬學(xué)盛，王新陸

(1.中國(guó)人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濟(jì)南 250031;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島 266071; 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

研究報(bào)告

復(fù)健片對(duì)大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)Nogo－A表達(dá)的影響

胡懷強(qiáng)1，周永紅2，馬學(xué)盛3，王新陸3

(1.中國(guó)人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濟(jì)南 250031;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島 266071; 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

目的觀察復(fù)健片在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)腦梗死大鼠腦組織Nogo－A表達(dá)的影響，探討其促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用機(jī)制。方法240只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和藥物組共四個(gè)大組，并根據(jù)腦梗死病程每組又分為3 d、1周、2周、4周、6周共5個(gè)亞組，每個(gè)亞組動(dòng)物數(shù)為12只。用改良的Longa EZ法制備大腦中動(dòng)脈阻塞大鼠模型，藥物組灌胃給予復(fù)健片水溶液，余各組分別灌胃給予同劑量的蒸餾水。用免疫組織化學(xué)法觀察模型大鼠梗死周邊區(qū)腦組織Nogo－A的表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠腦內(nèi)的Nogo－A在梗死后即開(kāi)始表達(dá)，逐漸增高，2周時(shí)達(dá)到高峰，第6周時(shí)還處于高表達(dá)狀態(tài)，明顯高于正常對(duì)照組。3 d時(shí)藥物組中Nogo－A的表達(dá)與模型組比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，其余各藥物組中Nogo－A表達(dá)與模型組比較均有非常顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)論復(fù)健片可抑制Nogo－A的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)再生。

復(fù)健片;腦梗死;神經(jīng)再生;抑制因子;Nogo－A

腦梗死后神經(jīng)功能重塑的因素十分復(fù)雜，包括促進(jìn)因素和抑制因素，能否有效解除抑制效應(yīng)是中樞神經(jīng)再生的關(guān)鍵［1］。Nogo－A是目前發(fā)現(xiàn)的最為強(qiáng)烈的神經(jīng)纖維再生抑制物質(zhì)，抑制損傷神經(jīng)發(fā)生，尤其是再生神經(jīng)纖維的長(zhǎng)距離生長(zhǎng)［2］。研究表明［3］，滋補(bǔ)肝腎的中藥復(fù)健片可明顯改善中風(fēng)患者神經(jīng)功能評(píng)分，可促進(jìn)中樞神經(jīng)再生作用，本研究首次通過(guò)給予復(fù)健片，觀察局灶性腦缺血模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中Nogo－A含量的變化，探討復(fù)健片在腦梗死后腦功能重塑中的作用機(jī)制。

1 材料方法

1.1 動(dòng)物和分組

成年SPF級(jí)雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠240只，體重250～300 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK(魯)20050015］，并于本動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行無(wú)菌手術(shù)，檢疫后備用，自由攝食進(jìn)水。顆粒大鼠飼料，由濟(jì)南康大飼料與山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心聯(lián)合生產(chǎn)［魯飼準(zhǔn)字364號(hào)］。動(dòng)物管理嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)科技部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范，使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。大鼠隨機(jī)分為:正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和藥物組共四個(gè)大組，并根據(jù)腦梗死病程每組又分為3 d、1周、2周、4周、6周共5個(gè)亞組，每個(gè)亞組動(dòng)物數(shù)為12只。

1.2 藥物與試劑

復(fù)健片，主要藥物為何首烏、草決明、桑寄生、海馬、淫羊藿等，由山東魯信藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào): 2007030701，并按照成人劑量的20倍［9 g/(kg·d)］將其制成水溶液，濃度為0.9 g/m L(即1 mL/100 g)，置于4℃冰箱中備用。Nogo－A單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 大腦中動(dòng)脈阻塞(M CAO)模型的制備

在Longa等［4］報(bào)道的方法基礎(chǔ)上改良后行MCAO術(shù)制作局灶性腦缺血模型。MCAO模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)采用Longa EZ評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［4］:0分，無(wú)神經(jīng)缺損表現(xiàn);1分，對(duì)側(cè)前爪不能充分伸展;2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒;4分，不能行走，意識(shí)喪失。動(dòng)物清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，1至3分者為納入標(biāo)準(zhǔn)，0分和4分者剔除。

1.4 給藥方法

于造模成功24 h后給藥，藥物組灌胃給予復(fù)健片水溶液1 m L/100 g，余各對(duì)照組分別灌胃給予1 m L/100 g劑量的蒸餾水，每日1次，每周連續(xù)給藥6 d，停1 d，并于取材當(dāng)天停藥。固體飼料和水自由攝取。各組均是每天給藥1次，每3 d稱體重1次，重新計(jì)算每只動(dòng)物藥量，直至取材時(shí)。

1.5 標(biāo)本制備

在取材的各時(shí)間點(diǎn)，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛PBS灌注固定取腦，然后將其浸于4%多聚甲醛中后固定。常規(guī)脫水浸蠟包埋，予正中隆起水平在切片機(jī)上行4 μm連續(xù)冠狀切片。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟至水;30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次;熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)，電爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復(fù)1次，自然冷卻后用PBS(pH 7.2～7.6)洗滌2次;滴加5%BSA封閉液，室溫20 m in，甩去多余液體，不洗;滴加兔抗鼠Nogo－A一抗(1∶50)，4℃過(guò)夜，PBS(pH 7.2～7.6)洗2 m in×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃20 m in。PBS (pH 7.2～7.6)洗2 min×3次;滴加試劑SABC，37℃20 m in，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 m in×4次; DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。免疫組織化學(xué)染色陰性對(duì)照用生物素化山羊抗兔IgG代替一抗，其余步驟同上，以檢查Nogo－A免疫反應(yīng)的特異性。

1.7 圖像分析

切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)下，在大腦梗死區(qū)周圍隨機(jī)選10個(gè)視野，運(yùn)用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，記錄平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用SAS8.1版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所用計(jì)量資料均采用±s(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果

各組大鼠MCAO術(shù)后Nogo－A蛋白表達(dá)的變化，見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠Nogo－A表達(dá)(±s)Tab.1 Expression of Nogo－A in all experimental groups at different stages

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠Nogo－A表達(dá)(±s)Tab.1 Expression of Nogo－A in all experimental groups at different stages

注:與同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組比較:☆☆t=－9.95，P＜0.0001;△△t=－17.02，P＜0.0001;▲▲t=－20.74，P＜0.0001;▽▽t=－12.25，P＜0.0001;▼▼t=－9.48，P＜0.0001。與同時(shí)間點(diǎn)的模型組比較，☆t=－1.63，P=0.1210＞0.05;△t=6.23，P＜0.0001;▲t=9.74，P＜0.0001;▽t=8.52，P＜0.0001;▼t=9.05，P＜0.0001。Note:Compared with the normal control group at the same stage:☆☆t=－9.95，P＜0.0001;△△t=－17.02，P＜0.0001;▲▲t=－20.74，P＜0.0001;▽▽t=－12.25，P＜0.0001;▼▼t=－9.48，P＜0.0001.Compared with the model group at the same stage:☆t=－1.63，P=0.1210＞0.05;△t=6.23，P＜0.0001;▲t=9.74，P＜0.0001;▽t=8.52，P＜0.0001;▼t=9.05，P＜0.0001.

時(shí)間點(diǎn)stage正常對(duì)照組Normal control假手術(shù)組Sham operation模型組Model藥物組Medicine 3 days 9.54±1.49 9.75±1.88 18.15±2.47☆☆20.00±2.57☆1 week 8.56±1.34 8.32±1.26 24.69±2.98△△17.63±1.33△2 weeks 8.76±1.37 8.90±2.25 30.33±3.26▲▲19.31±1.91▲4 weeks 9.50±3.43 9.57±2.20 27.32±3.09▽▽14.86±3.03▽6 weeks 10.10±2.18 8.96±2.66 20.69±3.05▼▼10.67±1.96▼

Nogo－A免疫陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色，在胞質(zhì)中表達(dá)。研究結(jié)果表明，正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠腦組織中的抑制因子Nogo－A處于較低的表達(dá)狀態(tài)，且在各時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有明顯的變化，且二者之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。模型組大鼠腦內(nèi)的Nogo－A在梗死后即開(kāi)始表達(dá)，逐漸增高，于2周時(shí)達(dá)到高峰，然后逐漸降低，至第6周時(shí)還處于高表達(dá)狀態(tài)，明顯高于正常對(duì)照組，且各時(shí)間點(diǎn)Nogo－A的表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異有非常顯著性(P＜0.01)。說(shuō)明神Nogo－A在腦梗死后較快的表達(dá)，在恢復(fù)期達(dá)到高峰，并在后遺癥期還處于高表達(dá)狀態(tài)，可見(jiàn)在腦梗死后各期Nogo－A均參與神經(jīng)再生抑制。藥物組大鼠梗死后腦內(nèi)的Nogo－A表達(dá)增高，其中，3d藥物組中Nogo－A的表達(dá)與模型組比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，其余各藥物組中Nogo－A表達(dá)與模型組比較差異均有非常顯著性(P＜0.01)，說(shuō)明復(fù)健片能有效解除神經(jīng)再生抑制。

3 討論

早在1928年，Cajal就認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生失敗的主要原因不是發(fā)出神經(jīng)纖維的神經(jīng)元的缺陷，而是缺乏適合的微環(huán)境［5］。大量研究認(rèn)為神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子的存在是中樞神經(jīng)系統(tǒng)難以有效再生可能的原因，怎樣棄除或減輕抑制因素對(duì)神經(jīng)軸突再生的抑制作用是目前研究的重點(diǎn)。目前相繼發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)具有抑制軸突再生的因子，美國(guó)加州大學(xué)Goldberg等［6］認(rèn)為Nogo基因的發(fā)現(xiàn)是“探索脊髓損傷和卒中病人治療漫長(zhǎng)道路中的一個(gè)里程碑”，其中Nogo－A具有最強(qiáng)的抑制神經(jīng)生長(zhǎng)的作用，并通過(guò)多位點(diǎn)的相互作用激活NgR啟動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制軸突再生和結(jié)構(gòu)的重塑性［7］。Nogo－A是CNS髓鞘磷脂神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)抑制因子，是一個(gè)主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞的胞體和突起表達(dá)的膜蛋白，其兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在抑制軸突生長(zhǎng)方面發(fā)揮著協(xié)同作用［8］，在CNS中提供限制神經(jīng)纖維延長(zhǎng)的生長(zhǎng)環(huán)境，它在體內(nèi)和體外都顯示出了抑制神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的作用［9，10］。在腦損傷后，Nogo－A可以抑制軸突再生［11］，而拮抗Nogo－A后所獲得的再生神經(jīng)纖維是有功能性的，并能形成有功能的突觸聯(lián)系［12］。因此，Nogo－A在具有高度可塑性的大腦區(qū)域的神經(jīng)元回路塑型過(guò)程中具有顯著的抑制作用，如不能有效解除抑制效應(yīng)，中樞神經(jīng)再生難以達(dá)到有效的康復(fù)水平。

近年來(lái)的研究證實(shí)，中藥可以誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生有利的微環(huán)境促進(jìn)神經(jīng)再生，但這些研究均是從促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)正性調(diào)節(jié)因子表達(dá)的角度來(lái)探討中藥的作用機(jī)制，而對(duì)能否下調(diào)抑制因素的表達(dá)，促進(jìn)缺血后重塑，鮮有報(bào)道。

中醫(yī)認(rèn)為，腦梗死的主要病機(jī)是機(jī)體在各種病理因素作用下，機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào)，肝腎陰精受損，風(fēng)火痰氣血等病理產(chǎn)物旋而變生，在各種誘因作用下引發(fā)而致。其病機(jī)關(guān)鍵為肝腎陰虛，肝腎陰虛成于中風(fēng)之先，是腦梗死發(fā)病的根本，已病之后貫穿于腦梗死的整個(gè)病理過(guò)程，且在其發(fā)展演變和治療過(guò)程中往往進(jìn)一步傷耗陰津。故宜采用滋補(bǔ)肝腎法治療腦梗死，復(fù)健片正是根據(jù)此法而設(shè)，由何首烏、淫羊藿、海馬等組成，具有調(diào)補(bǔ)肝腎之效，補(bǔ)腎以填精生髓，補(bǔ)肝以養(yǎng)春生之木氣，助腎生髓，肝腎并補(bǔ)，意在加強(qiáng)生髓以充腦。復(fù)健片是王新陸教授的經(jīng)驗(yàn)方，由制何首烏、桑寄生、草決明、海馬、淫羊藿等五味藥組成。何首烏為君藥，能滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)血益精。桑寄生為補(bǔ)腎補(bǔ)血要?jiǎng)?，且偏走于肢體筋脈;草決明，既有滋陰補(bǔ)肝腎之功，又有清肝熱熄肝風(fēng)之效，二味同有滋補(bǔ)肝腎之功，共扶何首烏固本培源，是為臣藥。海馬能補(bǔ)元陽(yáng)、調(diào)和氣血，淫羊藿有補(bǔ)命門(mén)肝腎，能壯陽(yáng)益精之效，二味皆為性溫之品，溫則行，一防滋膩;二可激發(fā)腎氣，和調(diào)陰陽(yáng);三有通行氣血之用，故稍佐此二味。諸藥合用，共奏滋補(bǔ)肝腎，益精補(bǔ)髓之功。

研究結(jié)果表明，Nogo－A免疫陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色，在胞質(zhì)中表達(dá)。正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠腦組織中的抑制因子Nogo－A一致處于較低的表達(dá)狀態(tài)。梗死后大鼠腦梗死區(qū)周圍的Nogo－A即開(kāi)始表達(dá)，并逐漸增高，于2周時(shí)達(dá)到高峰，然后逐漸降低，至第6周時(shí)還處于高表達(dá)狀態(tài)，明顯高于正常對(duì)照組，與正常對(duì)照組比較差異有非常顯著性(P＜0.01)。說(shuō)明Nogo－A始終參與中樞神經(jīng)再生。復(fù)健片干預(yù)的藥物組在3 d時(shí)與模型組之間Nogo－A表達(dá)差異無(wú)顯著性，其余各時(shí)間點(diǎn)藥物組與模型組比較差異均有非常顯著性(P＜0.01)，說(shuō)明復(fù)健片不能在短時(shí)間內(nèi)顯著抑制Nogo－A表達(dá)，可能是由于中藥起效緩慢所致。1周后復(fù)健片組大鼠腦梗死區(qū)周圍的Nogo－A表達(dá)受到顯著抑制。研究結(jié)果表明復(fù)健片可通過(guò)抑制神經(jīng)生長(zhǎng)負(fù)性調(diào)控因子的表達(dá)，解除中樞神經(jīng)再生的抑制，從而發(fā)揮促進(jìn)腦梗死后的神經(jīng)發(fā)生的作用，這也可能是中藥促進(jìn)腦梗死患者臨床康復(fù)的機(jī)制之一。

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Effect of a Traditional Chinese M edicine，“Fujian Tablet”，on Nogo-A Exp ression in Brain Tissue of Rats w ith Cerebral In farction at Different Stages

HU Huai－qiang1，ZHOU Yong－h(huán)ong2，MA Xue－sheng3，WANG Xin－lu3
(1.Department of Neurology，Jinan M ilitary Region General Hospital，Jinan 250031，China;2.Department of Traditional Chinese Medicine，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071; 3.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355)

ObjectiveTo observe the effect of a traditional Chinese nedicine，“Fujian tablet”，on the expression of Nogo－A in brain tissue of rats with cerebral infarction at the different stages，and to explore its mechanism on neural regeneration.M ethods Two hundred and forty healthy male Sprague－Dawley rats were random ly divided into 4 groups: normal control，sham operation，model and medicine groups，which were random ly divided into five subsets(n=12)at 3 d，1 w，2 w，4 w and 6 w stages after cerebral infarction，respectively.The rat models with middle cerebral artery occlusion were successfully established by an improved Longa EZ procedure.Fujian tablet was dissolved in water and given to the rats of treatment groups by gastric gavage，while the other groups received distilled water.The expression of Nogo－A in the brain tissue around the infarction was detected by immunohistochem istry.ResultsNogo－A expression was observed at a short period after cerebral infarction in the model group，and increased gradually，reached a peak at 2 weeks and was still positive at 6 weeks after infarction.The differences between model and normal control groups were significant at the same stage(P＜0.01).The difference between medicine group and model group was not significant(P＞0.05)at 3 days，but significant(P＜0.01)at other stages.ConlusionThe Fujian tablet can promote neurogenesis by inhibiting theexpression of Nogo－A.

Fujian tablet;Cerebral infarction;Neural regeneration;Inhibiting factor;Nogo－A

R－255

A

1005－4847(2010)02－0118－04

2009－08－10

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):30672745);山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(編號(hào):2006GG3202005)

胡懷強(qiáng)(1978－)，男，山東臨沂人，臨床醫(yī)學(xué)博士，博士后，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。E－mail:huhuaiqiang@126.com，TEL:013156189722