模擬HIV性傳播特點的SIVmac239恒河猴直腸黏膜感染

劉浩，劉強，叢喆，王衛(wèi)，喬紅偉，陳志偉，魏強

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021; 2.香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院艾滋病研究所，香港 999077)

研究報告

模擬HIV性傳播特點的SIVmac239恒河猴直腸黏膜感染

劉浩1，劉強1，叢喆1，王衛(wèi)1，喬紅偉1，陳志偉2，魏強1

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021; 2.香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院艾滋病研究所，香港 999077)

目的制備SIVmac239恒河猴(Macaca mulatta)細(xì)胞適應(yīng)株病毒，模擬HIV性傳播感染特點進行恒河猴直腸黏膜感染研究，探索引起系統(tǒng)性感染的病毒閾值水平與機體病毒、免疫學(xué)之間相關(guān)性，為我國艾滋病黏膜疫苗等生物制劑有效性評價提供新的模型構(gòu)建思路。方法參照HIV性傳播自然感染劑量范圍，選用SIVmac239連續(xù)升高的3種劑量直腸黏膜途徑感染兩只恒河猴，采取多種方法進行病毒血癥和免疫反應(yīng)特點分析。結(jié)果兩只恒河猴經(jīng)2×101TCID50和2×102TCID50病毒滴度2次攻擊后45 d，經(jīng)檢測均未建立系統(tǒng)性感染，病毒特異性免疫反應(yīng)均為陰性;第3次2×103TCID50病毒滴度攻擊后，M 296猴表現(xiàn)出典型的系統(tǒng)性感染特點，并誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。結(jié)論確認(rèn)了HIV性傳播過程中的病毒劑量效應(yīng)關(guān)系，為預(yù)防性生物制劑的猴體有效性評價提供了新的思路。同時，發(fā)現(xiàn)SIVmac239 Gag區(qū)特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)在病毒控制過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，對于新一代艾滋病黏膜疫苗的抗原選擇具有指導(dǎo)性意義。

SIVmac239;恒河猴;直腸黏膜感染;細(xì)胞免疫應(yīng)答

近年來，我國艾滋病流行形勢和特點發(fā)生了很大改變。2007年數(shù)據(jù)顯示，性傳播已經(jīng)成為最主要的傳播途徑。嚴(yán)峻的流行形式和流行特點迫切需要研制出安全有效的艾滋病黏膜疫苗。隨著艾滋病感染機制的深入研究，提倡建立模擬自然感染方式的動物模型進行候選疫苗的安全性、有效性以及免疫策略評價。因此，進行模擬HIV性傳播特點的恒河猴直腸黏膜感染研究顯得非常迫切和重要。本文用致病性SIVmac239細(xì)胞適應(yīng)株不同劑量經(jīng)直腸黏膜途徑連續(xù)接種恒河猴，在方法學(xué)探索研究的基礎(chǔ)上分析SIVmac239細(xì)胞適應(yīng)株在恒河猴直腸感染過程中的劑量效應(yīng)關(guān)系、以及感染模型病毒學(xué)、免疫學(xué)以及病理學(xué)等方面的變化特點，為今后利用此黏膜模型進行艾滋病早期感染和發(fā)病機制以及疫苗和殺微生物劑有效性評價等研究提供相關(guān)實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 SIVm ac239細(xì)胞適應(yīng)株制備

SIVmac239毒株由美國Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士惠贈。首先用Ficoll－paqueTMPlus(GE Healthcare，10027342)密度梯度離心法分離正常恒河猴外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMCs)，然后用CD8 M icroBead kit no human primate(M iltenyi Biotec，5090408090)和MACS Separation Columns (Miltenyi Biotec，130－042－901)進行CD8+T細(xì)胞陰選敲除，經(jīng)過SEB(0.5μg/m L)刺激3 d后，接種SIVmac239毒株，5%CO237℃培養(yǎng)。每隔3 d收集病毒上清液，“HIV－1 Antigen Microelisa system”(BioMerieux，284033)測定P24抗原濃度大于1 ng/ m L時收集病毒并于液氮保存。用TZM－bl方法測定病毒TCID［1］50。同時，利用病毒RNA Env區(qū)(M33262，6 846～8 481 bp，共1 636 bp)序列分析的方法分析毒株在制備過程中的變異［2］。

1.2 實驗動物

健康恒河猴2只，編號為M296和M546，購自北京協(xié)爾鑫公司［SCXK(京)2005－2005］。體重5 kg左右。經(jīng)間接免疫熒光法(IFA)檢測排除相關(guān)慢病毒(SIV、SRV－1，2，5、STLV－1)感染。猴免疫缺陷病毒(SIV)易感性密切相關(guān)的4種基因(Mamu－A*01、Mamu－A*02、Mamu－B*08、Mamu－B*17)篩查結(jié)果為陰性［3］。動物飼養(yǎng)及相關(guān)實驗在動物BSL－3實驗室(許可證號:CNAS BL0010)中進行。

1.3 SIVm ac239感染途徑及劑量

SIVmac239病毒原液用無血清RPM I1640培養(yǎng)液稀釋，采用劑量10倍連續(xù)提高(2×101TCID50起始，劑量1 m L，間隔3周)的攻毒方案，感染期間進行密集采樣檢測，直至至少一只恒河猴建立系統(tǒng)性感染為止。攻毒過程中恒河猴俯臥位，保證直腸黏膜充分暴露的情況下緩慢將病毒稀釋液注入肛竇處，保持俯臥位半小時。

1.4 外周血單核淋巴細(xì)胞(PBM Cs)中前病毒DNA的檢測

用QIAamp DNA blood minikit(Qiagen，51106)提取外周血基因組DNA，巢式PCR特異擴增外周血單個核淋巴細(xì)胞(PBMCs)中前病毒DNA，目的片段為Gag區(qū)312～788 bp(EU280806.2)，共477 bp［4］。

1.5 外周血病毒載量的測定

RNeasy m ini kit(Qiagen，74106)提取血漿中病毒RNA，Quantitect probe RT－PCR kit(Qiagen，204443)Roche LightCycler熒光定量儀測定血漿病毒RNA載量，該方法靈敏性為103copies/m L［5］。

1.6 外周血CD4+/CD8+值的測定

CD3－PerCP(BD，552851)、CD4－FITC(BD，550628)CD8－PE(BD，557086)抗體標(biāo)記全血中淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(Calibur FACS)測定CD4+/ CD8+比值［6］。

1.7 外周血總結(jié)合抗體滴度測定

恒河猴血漿樣品從1∶2開始2倍連續(xù)稀釋后，用“人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)”(生物梅里埃，A4 4284018－86)檢測交叉性體液免疫反應(yīng)，高于Cut－off值的最大血漿稀釋度定義為SIV特異性總結(jié)合抗體滴度［7］。

1.8 ELISPOT方法測定淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)

用Monkey IFN－r ELISPOT Kit(U－Cytech，CT126－PR20)檢測針對SIV肽庫的IFN－r分泌性ELISPOT反應(yīng)，肽庫為NIH提供的SIVmac239肽庫Gag(item#6204)、Env(item#6883)、Pol(item# 6443)，反應(yīng)終濃度為1.33 μg/m L［8］。

2 結(jié)果

2.1 SIVm ac239細(xì)胞適應(yīng)株制備及測定

2.1.1 SIVmac239細(xì)胞適應(yīng)株制備:收集的猴PBMC中CD8+T細(xì)胞敲除率達93%以上。本批制備病毒經(jīng)過3次PBMCs傳代，每代培養(yǎng)上清P24抗原濃度大于50 pg/mL進行傳代，整個傳代過程中PBMCs生長狀態(tài)良好，經(jīng)SEB刺激出現(xiàn)明顯的增殖成團現(xiàn)象，未見由于病毒侵染導(dǎo)致的明顯病理學(xué)改變。在12 d檢測P24抗原濃度達到1.02×103pg/ m L后(病毒量達到峰值)，收集病毒液200 m L，每支1 m L，液氮保存，批號為20090523。TZM－bl細(xì)胞檢測TCID50為2.13×104TCID50/m L。

2.1.2 SIVmac239細(xì)胞適應(yīng)株序列測定: SIVmac239細(xì)胞適應(yīng)株的Env區(qū)6210～7846 bp (EU280806.2)的克隆序列通過PubMed(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站BLAST程序分析，發(fā)現(xiàn)與SIVmac239(FJ838783)序列相似度為99%。經(jīng)Env區(qū)序列對應(yīng)的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)V3區(qū)頂端四肽沒有改變，SIVmac239 CCR5單嗜性沒有改變。

2.2 SIVm ac239連續(xù)升高3種劑量直腸黏膜途徑感染恒河猴實驗

2只恒河猴經(jīng)2×101TCID50和2×102TCID50兩次感染45 d后，各項指標(biāo)檢測表明兩只恒河猴均未獲得系統(tǒng)性感染，經(jīng)第3次病毒(2×103TCID50)感染后恒河猴的各項指標(biāo)如下:

2.2.1 SIVmac239感染恒河猴PBMC中前病毒DNA檢測:M296猴第1、2次感染前病毒DNA檢測結(jié)果均為陰性，第3次感染0 d、3 d檢測也為陰性;7 d后，開始在外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中擴增出病毒cDNA(目的片段在500 bp左右)，之后持續(xù)陽性。M546在整個病毒感染期檢測結(jié)果均為陰性(圖1)。

注:1～5.M296 0 d，7 d，63 d;M546 0 d，63 d樣品;6.陰性對照;7.陽性對照;M.DL2000 DNA marker。圖1 SIVmac239感染恒河猴后cDNA PCR檢測Note:1－5:M296 0 d，7 d，63 d;M546 0 d，63 d;6:negative control;7:positive control;M.DL2000 DNA marker.Fig.1 The PCR results of the monkeys after SIVmac239 infection.

2.2.2 SIVmac239感染恒河猴外周血病毒載量: M296猴第1、2次感染外周血病毒載量檢測結(jié)果均為陰性，第3次病毒感染后從第4天開始出現(xiàn)陽性，第14天達到RNA載量峰值(108.3RNA copies/m L plasma)，第18天后載量呈現(xiàn)下降趨勢(107.7RNA copies/m L p lasma降至105.5RNA copies/m L plasma)，感染80 d以后維持104copied/mL左右的載量水平(圖2 A)。M546猴的血漿病毒載量一直是陰性(圖2 B)。

注:A為M296外周血病毒載量情況;B為M546外周血病毒載量情況。圖2 SIVmac239感染恒河猴后外周血病毒載量檢測Note:A.The viral load in peripheral blood of M296;B.The viral load in peripheral blood of M546Fig.2 The viral load in peripheral blood of Macaca mulata after SIVmac239 virus infection.

2.2.3 SIVmac239感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值:第3次感染SIVmac239前，2只實驗猴的CD4+/CD8+比值均大于1，感染10d后，M296猴的CD4+/CD8+比值表現(xiàn)為倒置，感染后18 d達到最低點(0.45)，實驗期間內(nèi)一直維持倒置狀態(tài)(圖3 A)。M546猴CD4+/CD8+比值在感染7 d時出現(xiàn)一過性倒置(0.97)，之后很快恢復(fù)到感染前的正常水平(圖3B)。

2.2.4 SIVmac239感染恒河猴外周血總結(jié)合抗體滴度測定:第3次感染SIVmac239前，2只實驗猴的外周血總結(jié)合抗體滴度測定均為陰性。M296猴在第3次感染后第25天時開始檢測到抗體(滴度為1∶4)，之后抗體水平持續(xù)平穩(wěn)升高，84 d和91d時抗體滴度達到峰值(1∶2048)(圖4A)。M546猴在整個感染期抗體檢測均為陰性(數(shù)據(jù)未列出)。

2.2.5 SIVmac239感染恒河猴淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)測定:SIVmac239第3次感染后60 d IFN－r分泌性ELISPOT分析發(fā)現(xiàn)，M296誘導(dǎo)針對SIVmac239 Gag區(qū)較強的T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)(1，375 SFC per m illion PBMCs)，針對SIVmac239 Pol和Env區(qū)的淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)表現(xiàn)為弱陽性反應(yīng)(圖4B)。而M546則不能成功的誘導(dǎo)出針對這3個基因區(qū)的陽性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)(數(shù)據(jù)未列出)。

注:A為M296的CD4+/CD8+比值情況，B為M546的CD4+/CD8+比值情況。圖3 SIVmac239感染恒河猴后外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值Note:A.The CD4+/CD8+ratio of M296;B.The CD4+/CD8+ratio of M546.Fig.3 The CD4+/CD8+ratio of T lymphocytes in the peripheral blood of Macaca mulata after SIVmac239 infection.

注:A為M296體液免疫反應(yīng)情況;B為M546細(xì)胞免疫反應(yīng)情況圖4 M296猴感染SIVmac239誘導(dǎo)的免疫學(xué)反應(yīng)Note:A.The humoral immunity of M296;B.The cellular immunity of M546.Fig.4 The immune responses in M296 after SIVmac239 infection.

3 討論

本研究采用磁性細(xì)胞分選等技術(shù)通過在恒河猴PBMC細(xì)胞傳代的方法制備了大批量的SIVmac239細(xì)胞適應(yīng)株，并采用了在HIV性傳播自然感染范圍內(nèi)劑量連續(xù)提高的攻毒方案探索了SIVmac239直腸黏膜感染過程中的病毒劑量效應(yīng)關(guān)系。在建立系統(tǒng)性感染的M296猴T細(xì)胞免疫反應(yīng)分析后，發(fā)現(xiàn)針對SIVmac239 Gag區(qū)的ELISPOT反應(yīng)在病毒控制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

以往的實驗數(shù)據(jù)表明，很多針對來源于印度的恒河猴的SIV/SHIV強毒株，在感染恒河猴時都會表現(xiàn)出毒力下降的特點，這很大程度上限制了恒河猴艾滋病模型在疫苗和殺微生物劑有效性評價方面的應(yīng)用。針對這個問題，Pal等［9］學(xué)者采用將病毒感染恒河猴進行體內(nèi)毒力復(fù)壯的方法來獲取致病性強毒株。本實驗將SIVmac239在恒河猴PBMCs中進行體外連續(xù)傳代適應(yīng)，不僅節(jié)約了恒河猴資源，而且也避免了SIVmac239在恒河猴體內(nèi)的免疫壓力下發(fā)生變異的問題。最重要的是，SIVmac239細(xì)胞適應(yīng)株獲得了更多適合恒河猴感染的表型，這對于中國艾滋病疫苗和藥物評價動物模型的建立具有重要意義。

除此之外，本實驗采用HIV自然感染范圍內(nèi)攻毒劑量連續(xù)提高的方法來探索SIVmac239黏膜感染過程中的病毒劑量效應(yīng)關(guān)系。近幾年，很多研究團隊在艾滋病生物制劑的猴體評價研究中多采用大劑量單次感染或同等小劑量多次感染恒河猴的黏膜感染模型［10］，本研究根據(jù)HIV性傳播的特點，針對性設(shè)計了在自然感染劑量范圍內(nèi)連續(xù)提高(梯度小劑量多次)的攻毒方案，這對于建立最大限度模擬HIV自然感染狀態(tài)的SIV恒河猴黏膜感染模型將會提供有價值的參考數(shù)據(jù)和指導(dǎo)意義。同時，本模型研究可能成為現(xiàn)階段艾滋病疫苗等生物制品有效性評價的幾個常用模型策略的有益補充。

自從1983年HIV－1被發(fā)現(xiàn)以來，雖然廣大研究人員進行了26年的科研攻關(guān)，但是至今仍無法成功誘導(dǎo)針對HIV－1的保護性細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。因此，很多學(xué)者要求加強或深入研究HIV－1感染過程中保護性免疫反應(yīng)機制。以往很多觀點認(rèn)為病毒Env區(qū)是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細(xì)胞學(xué)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵部位［11］，近年來，雖然有的學(xué)者認(rèn)為病毒Gag區(qū)才是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細(xì)胞學(xué)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵部位［12］，但是雙方的意見分歧仍然較大。通過對M296猴ELISOPT結(jié)果分析表明，M296能誘導(dǎo)針對SIVmac239 Gag區(qū)的較強淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。這說明，恒河猴進行直腸黏膜途徑感染后，SIVmac239 Gag區(qū)特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)在病毒控制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對于新一代艾滋病黏膜疫苗的研制具有指導(dǎo)意義。

綜上所述，模擬HIV性傳播特點的SIVmac239恒河猴直腸黏膜感染研究，有助于研究HIV自然感染過程中的劑量效應(yīng)關(guān)系與感染機制，豐富了艾滋病預(yù)防性生物制劑的猴體有效性評價動物模型，并且對新一代艾滋病黏膜疫苗研制開發(fā)提供了參考數(shù)據(jù)。作為探索性研究，本實驗僅感染兩只恒河猴，所得實驗數(shù)據(jù)不能完全排除個體差異和未知因素的干擾，僅對HIV自然感染過程中的劑量效應(yīng)關(guān)系進行初步探索性研究，這個問題以及感染機制問題有待于進一步更為深入的研究。

(注:本文中恒河猴均特指產(chǎn)地于中國)。

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Infection of Rhesus M acaques by SIVm ac239 Virus Inoculated Rectally

LIU Hao1，LIU Qiang1，CONG Zhe1，WANG Wei1，QIAO Hong－wei1，CHEN Zhi－wei2，WEI Qiang1
(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China; 2.AIDS Institute，Li Ka Shing Faculty of Medicine，The University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China)

ObjectiveSIVmac239 virus was used to infect rhesus monkeys by rectal inoculation to mim ic sexually transmitted HIV infection.M ethods According to the dosage ranges of natural sexual HIV infection，two monkeys were rectally infected with three different serial doses of SIVmac239 virus.Meanwhile，the data of viremia and immune response were analyzed.Results Both two monkeys were negative by RT－PCR and ELISA method detection after serial challenge with 2×101TCID50and 2×102TCID50doses of virus.However，one monkey(M296)infected with 2×103TCID50for the third time established systemic infection and induced high level of humoral and cellular immune responses.ConlusionIn this study the dose－effect relationship on sexual HIV transm ission was confirmed.The SIVmac239 Gag specific cellular immune response has been suggested to play a key role in virus control，indicating the significance of antigen epitope selection for the new generation of mucosal AIDS vaccine.

SIVmac239;Rhesus Macaques;Rectal mucosal infection;Cellular immunity

R512.91

A

1005－4847(2010)02－0100－05

2009－11－03

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2006CB504200);國家十一五科技重大專項課題(2009ZX10004－402);國家自然科學(xué)基金資助項目(30870353)。

劉浩，碩士研究生，從事實驗動物病毒分子生物學(xué)研究工作。

魏強，博士生導(dǎo)師，研究方向:實驗動物病毒學(xué)。E－mail:weiqiang0430@sohu.com