水迷宮實驗中三種品系小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較

薛丹，徐淑萍，劉進修，，劉新民，李澎濤，劉華鋼

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所，北京 100193;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029; 3.廣西中醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530001)

研究報告

水迷宮實驗中三種品系小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較

薛丹1，2，徐淑萍1，劉進修1，3，劉新民1，李澎濤2，劉華鋼3

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所，北京 100193;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029; 3.廣西中醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530001)

目的探討三種品系小鼠在Morris水迷宮實驗中的學(xué)習(xí)記憶能力差異，為與改善學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)新藥研究的實驗動物選擇提供參考。方法選用C57BL/6小鼠、昆明種小鼠和ICR小鼠，進行定位航行實驗(5 d)、空間搜索實驗(1 d)和工作記憶實驗(4 d)，考察其學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果定位航行實驗從第3天起C57BL/6小鼠的潛伏期明顯小于昆明種小鼠和ICR小鼠(P＜0.01);空間搜索實驗C57BL/6小鼠穿過原平臺位置的次數(shù)、在原平臺象限游程比率和時間比率均明顯多于昆明種小鼠和ICR小鼠(P＜0.05);動物每天工作記憶實驗的潛伏期隨測試次數(shù)增加而縮短，C57BL/6小鼠縮短的較昆明種小鼠和ICR小鼠稍多。結(jié)論C57BL/6小鼠的空間參考記憶能力與工作記憶能力均優(yōu)于昆明種小鼠和ICR小鼠，且非空間因素對其學(xué)習(xí)記憶能力的評價干擾較小，可作為優(yōu)先選擇的水迷宮實驗動物。

品系差異;水迷宮;參考記憶;工作記憶

Morris水迷宮實驗［1］(Morris water maze test)是一種評價空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法，在二十多年來的廣泛應(yīng)用中實驗方法不斷改進及創(chuàng)新［2－5］，實驗對象也從最初的大鼠擴展到小鼠、人類(虛擬迷宮［6］)。對于使用最多的大鼠、小鼠不同品系間的水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力的比較已有報道［4;7］，但都只考察了空間參考記憶能力，主要采用經(jīng)典的定位航行實驗和空間搜索實驗方法［8］，對于近年來逐漸發(fā)展的工作記憶［3;9］方面卻并未涉及。本實驗采用常用的C57BL/6小鼠、昆明種小鼠和ICR小鼠，除比較它們在Morris水迷宮實驗中參考記憶能力的差異外，還通過工作記憶實驗［2］考察三種小鼠的工作記憶能力，以期為水迷宮實驗動物的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

C57BL/6小鼠和ICR小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2006－0009】，昆明種小鼠(KM)，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所【SCXK(京)2004－0001】，3種小鼠均為雄性，健康，購入時為6周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)12 d后進行Morris水迷宮實驗。

分組:①C57BL/6小鼠30只，實驗前1天體質(zhì)量19～24 g;②KM小鼠31只，實驗前1天體質(zhì)量34～40 g;③ICR小鼠30只，實驗前1天體質(zhì)量30～35 g。實驗室安靜，自然采光，動物分籠飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2 實驗儀器

小鼠Morris水迷宮在線檢測系統(tǒng)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國航天員科研訓(xùn)練中心、北京三維拓盟數(shù)字影像技術(shù)有限公司在本實驗室原有儀器［10］基礎(chǔ)上進一步開發(fā)，由一個不銹鋼噴塑圓柱形水池和圖像采集分析系統(tǒng)兩部分組成。水池直徑為100 cm，高38 cm。平臺直徑6 cm，高14 cm。按東南西北四個方向?qū)⑺仄骄鶆澐譃?個象限(NE、SE、SW、NW)，象限池壁圓弧中點為可選的動物入水點，平臺可置于任意一個象限的中央。圖像采集分析系統(tǒng)記錄動物游泳軌跡數(shù)據(jù)，用于指標(biāo)的提取及分析。

1.3 實驗方法

1.3.1 定位航行實驗(place navigation):歷時5 d，實驗前1天不放置平臺，讓小鼠自由游泳2 min。正式實驗時將平臺固定在SE象限，位于水面下1.5 cm，水溫穩(wěn)定在(25±0.5)℃。實驗室中的物品和人員的位置在實驗期間固定不變，作為動物的空間參照物。每天測試4次，每次從不同的入水點將動物面向池壁放入水中(入水點順序以半隨機的方法安排，以免動物按向左或向右的方法去定位［5］，同一次測試中所有動物的入水點相同)，檢測時間為60 s，在平臺上停留超過2 s則判為尋臺成功，將動物從入水到尋臺成功所需的時間記作逃避潛伏期，若60 s內(nèi)未找到平臺則潛伏期記為60 s。每次測試前先將動物置于平臺上停留15 s(稱為適應(yīng))，測試完畢不論尋臺是否成功均適應(yīng)10 s。計算每天潛伏期平均值，以評價動物空間記憶的獲得能力。

1.3.2 空間搜索實驗(spatial probe):定位航行實驗結(jié)束次日，拆除平臺，選擇NW象限作為入水象限，通過動物在60 s內(nèi)穿過原平臺位置的次數(shù)、原平臺象限游程比率及時間比率(即動物在原平臺象限的游程及時間占總游程及總時間的比率)來評價動物的空間記憶能力。

1.3.3 工作記憶實驗(spatial working memory):空間搜索實驗結(jié)束次日開始，歷時4 d，每天變換一次平臺的位置(依次位于SW、NE、NW、SE象限)，測試前不予適應(yīng)，測試后適應(yīng)5 s，其余實驗過程同定位航行實驗。以每次測試的潛伏期來評價動物的工作記憶能力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 定位航行實驗

注:**P＜0.01，***P＜0.001，與C57BL/6小鼠比較。圖1三種品系小鼠水迷宮實驗結(jié)果(定位航行) Note:**P＜0.01 and***P＜0.001，compared with C57BL/6 miceFig.1 Results of Morris water maze(place navigation)test in the three species of m ice

三種品系小鼠的潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加而逐漸縮短，前5d的總體學(xué)習(xí)成績的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.968，P＜0.001)。兩兩比較結(jié)果顯示，自第3天起，C57BL/6小鼠的潛伏期明顯短于KM和ICR小鼠(P＜0.01);而KM和ICR小鼠之間則無明顯差異(圖1)。進一步對組內(nèi)各時間點的潛伏期進行兩兩比較，結(jié)果顯示，三種品系小鼠第1～3天潛伏期之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而第4、5天潛伏期之間差異無顯著性，提示其學(xué)習(xí)成績已基本穩(wěn)定。

2.2 空間搜索實驗

三個品系小鼠穿越原平臺位置的次數(shù)、原平臺象限游程比率和時間比率上的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.218，P＜0.001)。C57BL/6小鼠的穿臺次數(shù)較KM和ICR兩組多(P＜0.05)，且原平臺象限游程比率和時間比率明顯高于其他兩組，差異有顯著性(P＜0.001)，而KM、ICR小鼠之間上述三種指標(biāo)均無明顯差異(表1)，提示C57BL/6小鼠對原平臺的空間位置記憶能力比KM和ICR小鼠強。

表1 三種品系小鼠水迷宮實驗結(jié)果(空間搜索)(±s)Tab.1 Results of Morris water maze test(spatial probe)in the three species of mice(±s)

表1 三種品系小鼠水迷宮實驗結(jié)果(空間搜索)(±s)Tab.1 Results of Morris water maze test(spatial probe)in the three species of mice(±s)

注:*P＜0.05，***P＜0.001，與C57BL/6小鼠比較差異有顯著性。Note:*P＜0.05 and***P＜0.001，compared with C57BL/6 mice.

組別Group數(shù)量n穿越原平臺次數(shù)Number of crossings in target quadrant原平臺象限時間比率(%) Percent time in target quadrant原平臺象限游程比率(%) Percent distance in target quadrant C57BL/6 30 3.66±0.45 47.1±2.2 46.1±2.1 KM 31 2.03±0.23*31.8±2.0***33.1±2.0***ICR 30 2.07±0.29*29.2±1.9***30.5±1.8***

2.3 工作記憶實驗

三種品系小鼠前3 d的潛伏期并未隨訓(xùn)練天數(shù)增加而縮短，而在第4天它們的潛伏期均明顯縮短，考慮與平臺位置同定位航行實驗中一致有關(guān)。如圖2所示，各組每天的潛伏期都有隨測試次數(shù)增加而縮短的趨勢，而C57BL/6小鼠縮短的較其他兩種小鼠稍多。同時觀察到，每天各組的平臺所在象限游程比率、時間比率隨測試次數(shù)有增加的趨勢，C57BL/6小鼠與其他兩種小鼠間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，具體數(shù)據(jù)未附上)。

注:a、b、c、d工作記憶實驗第1至4天的潛伏期。*P＜0.05，**P＜0.01，與C57BL/6組比較差異有顯著性。圖2三種品系小鼠水迷宮實驗結(jié)果(工作記憶)Note:a，b，c，d:Latency from the 1stto the 4thday in the working memory test.*P＜0.05 and**P＜0.01，compare with C57BL/6 mice.Fig.2 Results of Morris water maze test(working memory)in the three species of mice

3 討論

參考記憶存儲固定不變的信息，可由反復(fù)訓(xùn)練獲得，并可保持幾天到幾個月。定位航行實驗和空間搜索實驗均基于參考記憶，前者考察動物的空間學(xué)習(xí)獲得能力，后者考察其空間記憶保持能力［12］。本次實驗發(fā)現(xiàn)在參考記憶能力方面，C57BL/6小鼠表現(xiàn)較好，這與已有的研究結(jié)果相一致［4;7］。在定位航行實驗中，三種品系小鼠自第4天起潛伏期已基本穩(wěn)定，提示與本實驗相同周齡、品系的小鼠若采用本實驗方法可考慮訓(xùn)練4d。在空間搜索實驗中，除經(jīng)典的評價指標(biāo)穿臺次數(shù)外，我們同時采用了原平臺象限時間比率和游程比率兩個指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)這兩個指標(biāo)C57BL/6小鼠與其他兩種小鼠的差異更加明顯，提示在區(qū)別不同品系小鼠的參考記憶能力的差異方面，這兩個指標(biāo)可能較穿臺次數(shù)更加敏感。

與參考記憶不同，工作記憶具有暫存性，對復(fù)雜的認(rèn)知工作(如語言理解、學(xué)習(xí)和推理)所必需的信息進行臨時存儲和處理［13］，其容量有限，為了在正確的時間使用正確的信息，需忽略以前的相關(guān)信息。工作記憶實驗中，平臺的位置每天變換，當(dāng)天第一次測試中動物需對新平臺位置進行臨時存儲，并將此信息用于隨后的三次測試。本實驗中，我們觀察到前3 d盡管平臺已不在SE象限，第一次測試時三個品系的小鼠幾乎都會先在SE象限尋找平臺，之后有一部分會去前日平臺所在象限尋找，這個現(xiàn)象在C57BL/6小鼠上尤為明顯。一旦尋臺成功，在當(dāng)日隨后的測試中C57BL/6小鼠都能較快的找到平臺。第4天三個品系小鼠的潛伏期明顯短于前3 d，考慮與之前定位航行實驗中形成的參考記憶有關(guān)(平臺位置相同)。從實驗結(jié)果可以看出，C57BL/6小鼠的工作記憶能力較KM小鼠和ICR小鼠稍強。

參考記憶與工作記憶屬于兩種不同的記憶系統(tǒng)。二者的損害未必會同步發(fā)生，如Frick等［9］研究發(fā)現(xiàn)，與4月齡Fischer－344的大鼠相比，11、17、24月齡大鼠均有參考記憶能力的損害，而只有24月齡大鼠出現(xiàn)工作記憶能力的損害。本次實驗發(fā)現(xiàn)，不同品系小鼠在參考記憶和工作記憶上的差異大小不等，它們在工作記憶上的差異要小于參考記憶的差異。

同時我們在實驗中觀察到部分KM小鼠與ICR小鼠有時會出現(xiàn)漂浮不動及攀爬的情況，且多位于池壁附近，隨著測試次數(shù)的增加而有所減少。而C57BL/6小鼠則極少出現(xiàn)漂浮不動及攀爬的情況，這可能是由于它們對水迷宮的應(yīng)激反應(yīng)不同引起［7］。這種非空間因素在一定程度上影響了對其學(xué)習(xí)記憶能力的判斷。

綜上所述，C57BL/6小鼠、KM小鼠和ICR小鼠都能完成Morris水迷宮的定位航行實驗、空間搜索實驗和工作記憶實驗。在Morris水迷宮實驗中可優(yōu)先考慮選用綜合表現(xiàn)良好的C57BL/6小鼠，若選用其他兩種小鼠，則可在實驗初先采用線索學(xué)習(xí)、非空間預(yù)訓(xùn)練等方法對非空間因素的干擾進行控制［5］，再繼續(xù)進行學(xué)習(xí)記憶能力的檢測。

［1］Morris R.Spatial localization does not require the presence of local cues［J］.Learn Motiv，1981，12(2):239－260.

［2］Morris R.Developments of a water－maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.J Neurosci Methods，1984，11 (1):47－60.

［3］Steele RJ，Morris RGM.Delay－dependent impairment of a matching－to－place task with chronic and intrahippocampal infusion of the NMDA－antagonist D－AP5［J］.Hippocampus，1999，9(2):118－136.

［4］Upchurch M，Wehner J.Differences between inbred strains of mice in Morris water maze performance［J］.Behav genet，1988，18(1):55－68.

［5］Vorhees C，W illiams M.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］. Nature protocols，2006，1(2):848－858.

［6］Kallai J，Makany T，Karadi K，et al.Spatial orientation strategies in Morris－type virtual water task for humans［J］.Behav Brain Res，2005，159(2):187－196.

［7］李愛萍，趙慧，李韶等.不同鼠種在Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為中的種屬差異［J］.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2005，14(1): 29－31.

［8］龔夢鵑，王立為，劉新民.大小鼠游泳實驗方法的研究概況［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2005，19(05):311－314.

［9］Frick K，Baxter M，Markowska A，et al.Age－related spatial reference and working memory deficits assessed in the water maze［J］.Neurobiol Aging，1995，16(2):149－160.

［10］劉新民，陳善廣，王圣平等.益智中草藥研究中的一種新方法［J］.中草藥，1998，29(03):174－177.

［11］邱宏，金如鋒，趙玲，等.用SPSS11.0實現(xiàn)對重復(fù)測量資料的方差分析［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2006，19(02):162－165.

［12］Williams MT，Morford LL，Wood S L，et al.Developmental D－methamphetamine treatment selectively induces spatial navigation impairments in reference memory in the Morris water maze while sparing working memory［J］.Synapse，2003，48(3):138－148.

［13］Baddeley A.Working memory［J］.Science，1992，255:556－559.

Com parison of Learning and M em ory Abilities am ong Three Species of M ice Tested in M orris W ater M aze

XUE Dan1，2，XU Shu－ping1，LIU Jin－xiu1，3，LIU Xin－min1，LI Peng－tao2，LIU Hua－gang3
(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，
Beijing 100193，China; 2.Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029;3.Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning 530001)

ObjectiveTo investigate the differences of learning and memory abilities among three species of mice tested in Morris water maze.M ethods Place navigation，spatial probe and working memory tests were performed to determine the learning and memory abilities of C57BL/6，Kunming and ICR mice.ResultsC57BL/6 mice found the hidden platform faster than other two strains of mice in the place navigation test，showing a significant difference from the 3rdday(P＜0.01).In the spatial probe test，C57BL/6 mice spent more time in the target quadrant than other groups(P＜0.001).In working memory test，the escape latency of mice became shorter and shorter in four tests per day，and C57BL/6 m ice saved more time to the platform than Kunm ing m ice and ICR mice，but there was no significant difference between Kunm ing mice and ICR mice.Conlusions C57BL/6 mice perform better than Kunming mice and ICR m ice in spatial reference and working memory abilities.It may be more suitable for Morris water maze test.

Strain differences;Morris water maze;Reference memory;Working memory;M ice

R－33

A

1005－4847(2010)02－0149－04

2009－11－02

國家科技支撐計劃(2006BAI08B05－07);國家科技重大專項(2009ZX09502－014)。

薛丹(1983－)，女，博士生，研究方向:中藥神經(jīng)藥理。E－mail:xuedanxy@126.com

劉新民，博士生導(dǎo)師，E－mail:Liuxinmin@hotmail.com;李澎濤，博士生導(dǎo)師，E－mail:Lipengtao0413@hotmail.com