BALB/c－nu裸小鼠繁殖中雜合仔鼠剔除時(shí)間對(duì)純合裸仔鼠生長發(fā)育的影響

吳芳潔，楊文祥，駱偉，張金明，唐利軍

(湖北省疾病預(yù)防控制中心，武漢 430079)

研究報(bào)告

BALB/c－nu裸小鼠繁殖中雜合仔鼠剔除時(shí)間對(duì)純合裸仔鼠生長發(fā)育的影響

吳芳潔，楊文祥，駱偉，張金明，唐利軍

(湖北省疾病預(yù)防控制中心，武漢 430079)

目的研究屏障設(shè)施下裸小鼠繁殖生產(chǎn)時(shí)，在不同時(shí)間段剔除雜合仔鼠對(duì)純合裸仔鼠的成活率及生長發(fā)育情況的影響。方法選取25窩頭胎生BALB/c－nu新生裸小鼠按剔除雜合仔鼠的時(shí)間不同分成五組，以24 h剔除組為對(duì)照比較純合裸仔鼠生長發(fā)育及死亡率、離乳率的差異性，統(tǒng)計(jì)分析其生長發(fā)育過程中的體重增長等。結(jié)果剔除組生長發(fā)育及死亡率與對(duì)照組之間均存在差異性，其中14 d剔除組和21 d剔除組差異極顯著。結(jié)論剔除雜合仔鼠的時(shí)間對(duì)純合裸仔鼠的成活率及生長發(fā)育情況的有很大影響。為了保證SPF級(jí)裸鼠生長發(fā)育要求，生產(chǎn)繁殖出合格的實(shí)驗(yàn)用裸小鼠，剔除全部雜合仔鼠的最佳時(shí)間應(yīng)該在新生仔鼠出生24 h內(nèi)，超過3 d則會(huì)極大地影響純合裸小鼠的正常生長發(fā)育。

裸小鼠;繁殖;雜合仔鼠;純合仔鼠;剔除

無胸腺裸鼠的T淋巴細(xì)胞缺損，免疫機(jī)能低下，在一定情況下，不排斥來自異種動(dòng)物的組織移植，因此可作移植人類惡性腫瘤的接受體，作腫瘤藥物治療和腫瘤免疫的研究，同時(shí)也是研究病毒、細(xì)菌、寄生蟲、微生物感染機(jī)制及生物制品和藥品檢定的極好模型動(dòng)物，廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、毒理學(xué)等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究。目前，我國動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)裸鼠的需求量逐年增加，常用裸小鼠品系有:BALB/c－nu、NIH－nu、NC－nu、Swiss－nu、C3H－nu、C57BL－nu等［1］。

裸鼠的飼養(yǎng)和繁殖要求條件比較嚴(yán)格，我國已有這方面的經(jīng)驗(yàn)報(bào)道。繁育方式均采用♂nu/nu×♀nu/+，后代個(gè)體均有純合體“nu/nu”(無毛)和雜合體“nu/+”(有毛)之分，比例接近1∶1。只有無胸腺純合裸鼠(nu/nu)才符合實(shí)驗(yàn)用要求，雜合子裸小鼠(nu/+)僅部分胎次雌性可供留種，其余無經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但其個(gè)體強(qiáng)壯，搶乳力強(qiáng)，哺乳期內(nèi)在一定程度上會(huì)影響純合子裸小鼠的生長，使其體質(zhì)羸弱瘦小，甚至死亡。因此，在日常裸鼠生產(chǎn)繁殖工作中新生雜合子裸小鼠除需要保留少量雌鼠留種外，其余都應(yīng)盡快剔除淘汰，以保證純合裸仔鼠無搶奶對(duì)手，滿足純合裸鼠的生長需要。但是因?yàn)樾律槭蟛灰妆鎰e，文獻(xiàn)資料及相關(guān)理論書籍中也沒有明確的硬性規(guī)定指出雜合仔鼠的剔除時(shí)間，很多飼養(yǎng)員并沒有在第一時(shí)間將雜合仔鼠淘汰，而是等雜合仔鼠體表長出肉眼可見的小絨毛(7 d)后才剔除，甚至等離乳時(shí)(21 d)才分別飼養(yǎng)。而根據(jù)筆者多年飼養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，同日齡的純合裸仔鼠相比較，早剔除雜合仔鼠的會(huì)比晚剔除的成活率高，其21 d分窩時(shí)的體重也有很大區(qū)別。

為了證實(shí)筆者觀點(diǎn)，尋找出剔除雜合仔鼠的最佳時(shí)間，觀察剔除時(shí)間對(duì)裸鼠的生長發(fā)育及成活率的影響，特選取25窩頭胎生BALB/c－nu新生裸小鼠按剔除雜合仔鼠的不同時(shí)間分成五組，比較純合裸小鼠生長發(fā)育及死亡率的差異性，其數(shù)據(jù)結(jié)果可供有關(guān)科研人員參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:25窩SPF級(jí)BALB/c－nu新生裸小鼠，所配雄性鼠為純合(nu/nu)雄鼠，母鼠為雜合(nu/+)雌鼠，均為初配，所生仔鼠同為頭胎。全部25只孕鼠產(chǎn)仔日期間隔在2d以內(nèi)。來源于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心【SCXK(鄂)2008－0005】。本實(shí)驗(yàn)在湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心SPF級(jí)屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK(鄂)2008－0014】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 飼養(yǎng)條件:屏障系統(tǒng)為初、中、高三級(jí)過濾結(jié)構(gòu)，10 000(萬)級(jí)空氣凈化飼養(yǎng)室。內(nèi)置層流柜(JD－25潔凈層流柜，由蘇州實(shí)驗(yàn)動(dòng)物器材廠生產(chǎn))?？諝饨?jīng)初中高效過濾器過濾后送入層流柜。潔凈等級(jí)為100級(jí)，風(fēng)速大于﹥0.2m/s。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)環(huán)境:溴化鋰吸收式冷溫水機(jī)組24 h控溫，溫度區(qū)間為22～26℃;相對(duì)濕度:50%～70%;噪音:＜60 dB。

1.1.4 飼料、飲水、墊料:飼料營養(yǎng)成份均按國家標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，均經(jīng)過高壓蒸汽滅菌消毒;飲水經(jīng)杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水處理器過濾凈化;墊料為高壓蒸汽滅菌刨花。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理:將25窩新生鼠隨機(jī)分為5組，每組在不同時(shí)間將雜合仔鼠全部剔除，僅留純合裸仔鼠哺乳。設(shè)24h內(nèi)剔除雜合仔鼠(nu/+)組;3d剔除雜合仔鼠(nu/+)組;7d剔除雜合仔鼠(nu/+)組;14d剔除雜合仔鼠(nu/+)組;21 d離乳不剔除組。21 d時(shí)各組仔鼠全部離乳。

孕鼠生產(chǎn)后，新生仔鼠可根據(jù)無鼻毛或有少量卷曲鼻毛的特征作為辨認(rèn)是否為純合子的依據(jù)。無鼻毛或有少量卷曲鼻毛的為純合子裸鼠(nu/nu);鼻毛濃密且胡須筆直外展的為雜合仔鼠(nu/+)［2］。出生后即可辨別。每組按以上特征在不同時(shí)間剔除新生雜合仔鼠，純合裸鼠全部保留。如實(shí)記錄各窩產(chǎn)仔數(shù)、死亡率、各期體重等生長發(fā)育情況。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠繁殖性能及離乳率

實(shí)驗(yàn)各組平均產(chǎn)仔數(shù)相比差異無顯著性(P＞0.05)。平均產(chǎn)裸仔數(shù)各組相比差異無顯著性(P＞0.05)。而與24h剔除組相比較，裸仔死亡數(shù)、裸鼠離乳育成率3d剔除組差異無顯著性(P＞0.05)，7d剔除組差異顯著(P＜0.05)、14 d、21 d剔除組差異極顯著(P＜0.01)見表1。

2.2 平均體重增長情況

在本實(shí)驗(yàn)中，各組雜合仔鼠和純合裸仔鼠生長發(fā)育情況有相當(dāng)大的差異。與24 h剔除組相比較，純合裸仔鼠初重及3 d體重各組差異均無顯著性(P＞0.05)。7 d體重3、7、14、21 d剔除組差異有顯著性(P＜0.05)。2周體重7、14、21 d剔除組雌性差異均有顯著性(P＜0.01)，雄性7 d剔除組差異有顯著性(P＜0.05)，4 d、21 d剔除組差異有顯著性(P＜0.01)。3周體重7 d剔除組差異有顯著性(P＜0.05)，4 d、21 d剔除組差異有顯著性(P＜0.01)。4周體重3 d、7 d剔除組差異有顯著性(P＜0.05)，14 d、21 d剔除組差異有顯著性(P＜0.01)。見表2。

表1 裸鼠繁殖性能、純合裸仔鼠成活情況及離乳率比較Tab.1 Comparison of the reproductive performance of nude mice，the survival and weaning rate of homozygous offsprings

表2 各組純合(雜合)裸仔鼠平均體重增長表(±s，g)Tab.2 The average weight gain of homozygous nude mouse(The heterozygous)offsprings in each group(±s，g)

表2 各組純合(雜合)裸仔鼠平均體重增長表(±s，g)Tab.2 The average weight gain of homozygous nude mouse(The heterozygous)offsprings in each group(±s，g)

注:*表明與24 h剔除組相比較差異有顯著性(P＜0.05)，**表明與24 h剔除組相比較差異有顯著性(P＜0.01)。Note:*Indicates a significant difference compared with that of 24 h－removal group(P＜0.05)，**indicate a very significant difference compared with that of 24 h－removal group(P＜0.01).

組別Group初重Initial weight 3 d 3 d－weight 7 d 7 d－weight 2周2 w－weight 3周3 w－weight 4周4 w－weight雌性Famale 24 h剔除組24 h－removal group 1.0±0.1 2.3±0.1 5.0±0.7 7.3±0.2 10.0±0.8 12.2±0.9 (0.9±0.3)－－－－－3 d剔除組3 d－removal group 1.0±0.4 2.2±0.3 3.8±1.1*7.0±0.4 9.8±1.0 10.5±1.2*(1.2±0.4)(2.4±0.3*)－－－－7 d剔除組7 d－removal group 0.9±0.5 2.0±0.7 3.8±0.7*5.8±0.7**8.5±0.7*9.1±0.7*(0.9±0.7)(2.2±0.3*)(5.8±0.4*)－－－14d剔除組14 d－removal group 1.1±0.2 2.1±0.5 3.3±2.4*4.5±2.1**6.5±3.1**7.3±0.7**(1.0±0.4*)(2.4±0.6*)(5.1±2.0*)(7.6±2.1*)－－21 d離乳組21 d－weaning group 1.2±0.4 2.1±0.4 3.5±2.1*4.1±1.1**6.0±2.8**6.5±3.3**(1.1±0.2)(2.3±0.4*)(5.3±0.9*)(6.9±2.3**)(9.0±2.5**)(13.8±2.3**)雄性Male 24 h剔除組24 h－removal group 1.3±0.5 2.5±0.1 5.4±0.3 7.6±0.3 10.2±0.7 13.6±0.5 (1.1±0.4)－－－－－3 d剔除組3 d－removal group 1.2±0.6 2.3±0.4 4.7±0.9 6.6±0.7 10.5±1.2 14.5±0.7 (1.2±0.6)(2.6±0.5*)－－－－7 d剔除組7 d－removal group 1.1±0.3 2.4±0.8 4.0±0.7*5.8±1.4*8.5±1.8*9.6±0.7*(1.1±0.3)(2.4±0.7*)(6.1±1.0**)－－－14 d剔除組14 d－removal group 1.3±0.3 2.4±0.7 3.8±1.5*4.5±0.7**6.5±2.8**7.5±3.0**(1.3±0.3)(2.7±0.9*)(5.9±1.7**)(8.0±0.9**)－－21 d離乳組21 d－removal group 1.2±0.4 2.2±0.3 3.6±2.0*4.5±1.0**5.8±2.9**7.9±2.7**(1.2±0.4)(2.5±0.6*)(6.4±0.8**)(8.5±1.4**)(11.2±2.1**)(14.2±2.7**)

并且，雜合仔鼠的體重與純合裸仔鼠的體重同期有較大區(qū)別，3 d體重差異有顯著性(P＜0.05)，7 d之后體重相比較差異有顯著性(P＜0.01)。見表2。

由21 d離乳組仔鼠生長曲線圖可見，同期的雜合子生長發(fā)育情況明顯好于純合裸仔鼠，純合裸仔鼠的生長曲線平緩無峰，與雜合仔鼠曲線差距明顯，其體重增長緩慢，表現(xiàn)出明顯營養(yǎng)不良、生長發(fā)育遲緩的癥狀。見圖1。

圖1 21 d離乳組雜合仔鼠與純合裸仔鼠平均體重增長對(duì)照表Fig.1 comparison of the average body weight of weaning heterozygous and homozygous offsprings in 21 days

3 討論

裸鼠獨(dú)特的生產(chǎn)繁殖方式?jīng)Q定了其乳鼠中雜合子、純合子并存的狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)證明為了保證裸小鼠的生長發(fā)育要求，人工剔除雜合子是非常必要的，并且有時(shí)間要求。分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并結(jié)合長期裸小鼠的生產(chǎn)繁殖工作，筆者得出如下幾點(diǎn)結(jié)論:

3.1 雜合仔鼠搶奶能力非常強(qiáng)，應(yīng)在第一時(shí)間剔除

雜合仔鼠(nu/+)其個(gè)體天生強(qiáng)壯，搶乳能力非常強(qiáng)，在哺乳期會(huì)嚴(yán)重影響裸小鼠的生長發(fā)育。裸仔鼠體格弱小，如果沒有充足奶源供給，必然導(dǎo)致發(fā)育不良，在哺乳期中容易死亡。由本實(shí)驗(yàn)可見，24 h內(nèi)剔除雜合子的純合裸小鼠體格發(fā)育健康，除天生體弱有個(gè)別死亡外，其余均生長正常。而哺乳中晚期剔除組，幾乎每窩均有裸鼠死亡，甚至個(gè)別窩裸鼠全部死亡。就算有一些瘦弱裸鼠存活至離乳，其體重也明顯低于正常水平，其外觀體態(tài)典型營養(yǎng)不良，后期發(fā)育非常遲緩，明顯低于正常標(biāo)準(zhǔn)，壽命也較正常裸鼠短，根本不能作為科學(xué)實(shí)驗(yàn)的供體，失去了科研價(jià)值。因此，剔除雜合仔鼠對(duì)純合裸鼠的成活率有較大影響，在3 d內(nèi)盡早剔除非常必要。

根據(jù)資料記載，一般裸仔鼠從初生到離乳，是體重增長最為迅速的一個(gè)過程，呈直線上升趨勢(shì)。到3周齡離乳時(shí)，已超過初生體重的7倍以上，但體重增長速度在雌雄不同性別水平上差異表現(xiàn)不顯著［2］。而由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，出生3 d后和雜合仔鼠一同哺乳的裸仔鼠，體重增長緩慢，7 d后便顯現(xiàn)明顯營養(yǎng)不良癥狀。因此筆者認(rèn)為剔除雜合仔鼠的時(shí)間最好在出生24 h內(nèi)，絕不可超過出生后3 d，否則將嚴(yán)重影響裸小鼠生長發(fā)育。對(duì)此，裸鼠飼養(yǎng)人員應(yīng)該提高自身專業(yè)能力，多練習(xí)辨別雜合子與純合子裸小鼠，保證在新生鼠24 h內(nèi)準(zhǔn)確快速的進(jìn)行剔除工作，同時(shí)做到不驚嚇生產(chǎn)母鼠，以免發(fā)生食仔、停乳現(xiàn)象。

3.2 雜合仔鼠留種也應(yīng)盡量找代乳母鼠或無裸仔鼠母鼠集中哺乳

雜合子對(duì)純合裸小鼠生長發(fā)育影響大，在需要雜合子雌性留種時(shí)，也最好不要同窩留種，即不要雜合子與純合子一起哺乳，而應(yīng)該分開。雜合子體格強(qiáng)壯，適應(yīng)力強(qiáng)，最好為其找代乳母鼠集中哺乳，一只母鼠最多可帶10只雜合仔鼠。需要注意的是，哺乳期母鼠會(huì)根據(jù)氣味認(rèn)仔，對(duì)非親生仔鼠往往會(huì)食仔。因此，代乳母鼠最好為護(hù)仔性強(qiáng)、無食仔史的青壯年經(jīng)產(chǎn)鼠，并在同窩前不要換窩，先將母鼠提出，將仔鼠放入窩中滾上墊料，沾染其親生鼠和母鼠糞便氣味，幾分鐘后再將母鼠放回窩中，能有效避免食仔。如果找BALB/c或KM小鼠等不同種母鼠代乳，則要將其親生仔鼠剔除以免混淆。

值得注意的是，雜合仔鼠的影響僅是保證裸仔鼠的生長發(fā)育的一個(gè)方面，還有母鼠胎次、生產(chǎn)只數(shù)、哺乳期營養(yǎng)、哺乳期環(huán)境等諸多因素可影響裸仔鼠的正常發(fā)育，或造成其死亡，在今后的研究中，筆者將會(huì)進(jìn)一步探討。

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Im pact of Rem oval Tim e of Heterozygous O ffsp rings on the G row th and Developm ent of Hom ozygous O ffsp rings in BALB/c-nu Nude M ouse Breeding

WU Fang－jie，YANG Wen－xiang，LUO Wei，ZHANG Jin－ming，TANG Li－jun

(Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention，Wuhan 430079，China)

ObjectiveIn order to study the impact of various removal times of heterozygous offsprings on the survival rate，growth and development of the homozygous offsprings of nude m ice in barrier breeding facilities of nude mice production.M ethods 25 farrows BALB/c－nu offspring mice were selected，and divided into 5 groups according to different removal times of heterozygous offspring.The grow th and development，weaning rate were recorded and statistical analysis of body weight was performed.Results The growth and mortality of the four groups showed significant difference compared with that of the control group(P＜0.05)，among them，the 14d－and 21d－removal groups showed a very significant difference(P＜0.01).ConlusionVarious times of removing heterozygous nude mouse offsprings have a strong impact on the survival rate，growth and development of the homozygous nude mouse offsprings.In order to meet the grow th and development requirements of SPF nude mice，we suggest to remove all heterozygous nude mouse offsprings within 24 hours after the birth of neonates.Removal of heterozygous nude mouse offsprings at 3 days or later will have considerable influence on the normal grow th and development of homozygous nude mouse offsprings.The data of this study may provide useful reference for researches in this field.

Nude mice;Breeding;Removal;Hheterozygous offspring;Homozygous offsprings

Q95－331

A

1005－4847(2010)02－000－0

2009－07－22

吳芳潔(1982－)，女，助理獸醫(yī)師，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)管理工作。

唐利軍，男，研究員，湖北省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理首席專家，從事衛(wèi)生管理工作。