腦缺血再灌注半暗帶細(xì)胞凋亡及 Bcl-2/Bax比值的變化及中藥干預(yù)機(jī)制*

薛 茜 鄒玉安 趙寶民 楊向方河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(張家口 075000)

近年來研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷后導(dǎo)致的遲發(fā)神經(jīng)元損傷,主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等有關(guān) ,其中神經(jīng)細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的自主性、程序性細(xì)胞死亡過程,是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié),而 Bcl-2/Bax比值變化與細(xì)胞凋亡調(diào)控有關(guān)。本研究通過觀察大鼠局灶性腦缺血再灌注后缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡和 Bcl-2/Bax比值的變化及其康腦液Ⅰ號(hào)對其的影響,探討其可能的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性 SD(Sprague-Dawley)大鼠 120只 ,體重 (270± 20)g,SPF/U AF級,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,許可證號(hào):SCXK(京 )2006-0008。稱重后隨機(jī)將大鼠分成 4組,每組 30只。①假手術(shù)組;②模型組 (缺血再灌組);③鹽酸法舒地爾注射液組;④康腦液 1號(hào)組。除假手術(shù)組外,各組均缺血 2h,再灌 12h、24h、 72h。

1.2 動(dòng)物模型制備 采用改良 Longa法[1]復(fù)制 MCAO模型,大鼠用 7%水合氯醛 (350mg/kg)腹腔注射麻醉,模型組及康腦液 1號(hào)組插入深度為(20±0.5)mm;假手術(shù)組麻醉同上,頸部切口暴露頸外動(dòng)脈,不插線。動(dòng)物清醒后采用 Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分(0分:無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);1分:對側(cè)前爪不能充分伸展;2分:行走時(shí)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜;4分:不能行走,意識(shí)喪失 ),1～3分者納入實(shí)驗(yàn),不符合模型判斷標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物剔除。

1.3 藥物與試劑 康腦液 1號(hào),由黃芪、三七等 8味中藥組成,由河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院中藥房煎制。常規(guī)煎煮并濃縮至 4g/mL?？的X液 1號(hào)采用灌胃法,鹽酸法舒地爾注射液采用腹腔注射,均連續(xù)給藥 7d,每天早晨給藥 1次,最后一次給藥 1h后實(shí)施腦缺血再灌注手術(shù),給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算,康腦液 1號(hào)組劑量為 3g/100g?d。假手術(shù)組和模型組動(dòng)物自手術(shù)日前 7d開始給予等量去離子水灌胃。觀察各組大鼠術(shù)畢清醒后的 Longa評分和術(shù)后的活動(dòng)度變化。鹽酸法舒地爾注射液(川威):天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字 H20040356;產(chǎn)品批號(hào):060608;規(guī)格 2mL:30mg)。栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品編號(hào) 2432-100,線長 40mm,線身直徑 0.24mm,頭端直徑 0.32±0.02mm)。凋亡試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 (產(chǎn)品批號(hào):10090522)。

1.4 TTC染色及腦梗死面積測定 缺血 2h再灌注 24h后,每組隨機(jī)抽取 6只大鼠,快速斷頭取出鼠腦,置冰箱(-20℃)內(nèi) 10 min后,切除嗅腦,取冠狀面從前向后均勻切成2mm厚腦片 5～6片,將切片迅速置于 2% TTC溶液 (37℃水浴)中避光條件下染色 30min。正常腦組織染成紅色,缺血區(qū)呈灰白色 ,界線清晰。4%多聚甲醛固定 24h。數(shù)碼相機(jī)攝片,計(jì)算機(jī)圖像分析,求得 T TC染色兩側(cè)正常區(qū)與梗死灶的面積。以缺血對側(cè)腦片的面積減去缺血側(cè) TTC染色正常區(qū)的面積求得腦梗死面積。

1.5 動(dòng)物灌注固定與取材 將實(shí)驗(yàn)大鼠缺血 2h,至再灌注所需時(shí)間點(diǎn)時(shí),7%水合氯醛腹腔注射麻醉,常規(guī)從主動(dòng)脈灌注 4%多聚甲醛 150mL固定 30min?？焖贁囝^取腦,從前向后將腦組織分為 A、B、C、D、E五等分,切成厚度約 2～3mm厚的腦片,選取 C腦片,入 4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定 24 h。

1.6 切片制備及 HE染色 常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚度 5μm,4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?HE染色觀察病理形態(tài)。

1.7 腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的地高辛 dUT P缺口末端標(biāo)記法 (TUNEL)來識(shí)別凋亡細(xì)胞。試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品批號(hào):10090522)。

1.8 Bcl-2/Bax比值測定 SP法檢測,陰性對照用 0.01mol/L PBS(pH7.4)代替一抗。免疫組織化學(xué)法采用 SP法,操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行,DAB顯色,常規(guī)脫水、透明、封片?？贵w及試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(PV-6001批號(hào):K92708D)?？贵w稀釋液:ZL1-9029批號(hào):546892A。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評分及腦梗死體積 大鼠M CAO術(shù)后多于 1.5h內(nèi)清醒。假手術(shù)組大鼠活動(dòng)度大。模型組術(shù)后精神較差,反應(yīng)遲鈍,蜷縮扎堆,24h后仍然有蜷縮扎堆現(xiàn)象?？的X液 1號(hào)組和鹽酸法舒地爾組的狀態(tài)有一定好轉(zhuǎn),活動(dòng)度較大,無扎堆蜷縮。術(shù)后 2h～24h內(nèi)神經(jīng)功能缺損癥狀較重,Longa評分較高。術(shù)后 24h康腦液 1號(hào)組和鹽酸法舒地爾組 Longa評分低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(表1)。缺血再灌注 6h即可看到明顯梗死灶,累及右側(cè)大腦半球基底節(jié)區(qū)、額頂葉皮層及海馬區(qū),隨再灌流時(shí)間的延長梗死面積百分比逐漸增大,至缺血再灌注 24h時(shí),梗死體積百分比為(43.00±0.68)%?？的X液 1號(hào)組為(35.00± 0.37)%?？的X液1號(hào)組比模型組梗死面積明顯減小(P＜0.05)。

表1 康腦液 1號(hào)對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分的影響()

表1 康腦液 1號(hào)對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分的影響()

注:與假手術(shù)組比較,▲P＜0.05;與模型組比較,△P＜0.05

再灌注后神經(jīng)功能行為學(xué)評分組 別 n2h 24h 48h假手術(shù)組 30 0 0 0模型組 30 1.90±0.74▲ 2.10±0.74▲ 2.60±0.52▲鹽酸法舒地爾組 30 1.80±0.63 1.90±0.74 2.40±0.52康腦液Ⅰ 號(hào)組 301.20± 0.42▲△ 1.30± 0.48▲△ 1.10± 0.32▲△

2.2 組織病理學(xué)改變 高倍光鏡下,①假手術(shù)組:大腦組織結(jié)構(gòu)完整,無梗死灶及水腫。神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞未見異常。胞膜、核膜清晰 ,核仁明顯。②模型組:缺血第 1d,缺血對側(cè),細(xì)胞形態(tài)正常,核仁清楚。缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,排列紊亂,組織間隙水腫嚴(yán)重。缺血半暗帶明顯,神經(jīng)細(xì)胞稍小,形態(tài)基本正常;缺血灶中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞面積明顯縮小,部分細(xì)胞呈三角形,膠質(zhì)細(xì)胞固縮。缺血第 7～14d神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及毛細(xì)血管、小血管與周圍腦間質(zhì)的間隙顯著增大,間質(zhì)疏松。病灶中心區(qū)隨時(shí)間延長出現(xiàn)大量液化性壞死灶及囊性變,后期呈網(wǎng)狀改變,殘存細(xì)胞很少。③康腦液 1號(hào)組及鹽酸法舒地爾組:在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與模型組相比,神經(jīng)元形態(tài)改變較輕,胞體完整,突起較清楚,基本保持完整。可見尚存的大腦皮質(zhì)的正常神經(jīng)元排列結(jié)構(gòu),且組織間隙水腫較模型組明顯減輕,神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管大量變性壞死等缺血性改變和炎性反應(yīng)明顯輕于模型組。各組病理組織學(xué)改變提示大鼠 M CAO模型制備成功。

2.3 大鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡及 Bax/Bcl-2比值變化及其康腦液 1號(hào)對其的影響 光鏡下(× 400)細(xì)胞核內(nèi)存在棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。在梗死周邊區(qū)隨機(jī)選取 10個(gè)互不重疊視野,計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。各時(shí)間點(diǎn)模型組細(xì)胞凋亡數(shù)及 Bcl-2/Bax比值明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);與模型組比較,康腦液 1號(hào)組、鹽酸法舒地爾組均可明顯降低缺血后大鼠缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡(P＜0.05),而 Bcl-2/Bax比值升高,康腦液 1號(hào)組效果尤為顯著 (P＜0.01)(表 2、3)。

表2 康腦液 1號(hào)對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響()

表2 康腦液 1號(hào)對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響()

注:與假手術(shù)組比較,▲P＜0.05;與模型組比較,△P＜0.05

梗死灶周邊神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目(個(gè) /400倍視野)組 別 n12h 24h 72h假手術(shù)組 30 0.80± 0.42 1.00± 0.67 0.90± 0.57模型組 3037.30± 3.68▲ 51.60± 3.47▲ 7.30± 1.64▲鹽酸法舒地爾組 30 29.30±2.75 44.70±7.17 5.50±1.84康腦液 1號(hào)組 3015.10± 1.60▲△27.20± 0.79▲△ 4.80± 1.14▲△

表3 康腦液 1號(hào)對缺血再灌注大鼠缺血半暗帶 Bcl-2/Bax比值的影響()

表3 康腦液 1號(hào)對缺血再灌注大鼠缺血半暗帶 Bcl-2/Bax比值的影響()

注:與假手術(shù)組比較,▲P＜0.05;與模型組比較,△P＜0.05

Bcl-2/Bax比值組 別 n 12h 24h 72h假手術(shù)組 30 0.47± 0.30 0.47± 0.30 0.47± 0.30模型組 30 0.49±1.20▲ 0.41±0.16▲ 0.40±1.10▲鹽酸法舒地爾組 30 0.52±1.90▲ 0.53±0.24▲ 0.55±0.34▲康腦液Ⅰ 號(hào) B組 300.54± 1.55▲△ 0.57± 1.21▲△ 0.61± 0.19▲△

3 討 論 研究表明,神經(jīng)細(xì)胞凋亡是缺血性腦損傷后細(xì)胞死亡的重要形式[2],缺血半暗帶的細(xì)胞凋亡與疾病轉(zhuǎn)歸相關(guān),細(xì)胞凋亡的機(jī)制與凋亡基因表達(dá)有關(guān),即促凋亡基因和抗凋亡基因。Bcl-2、Bax基因是目前研究較明確的一對在功能上相互對立的凋亡調(diào)控基因,細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序決定于 Bcl-2蛋白和 Bax蛋白的相對值,Bcl-2/Bax的比率改變與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)[3]。

Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白,主要分布于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞核的外膜[4]。Bcl-2蛋白家族根據(jù)其作用分為 2類:一類為抗凋亡蛋白,如 Bcl-2蛋白;另一類為促凋亡蛋白,如Bax蛋白。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間相互拮抗。Bcl-2蛋白能夠抑制 Bax蛋白啟動(dòng)的凋亡機(jī)制。而 Bax蛋白作為 Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員,可以不依賴于激活或抑制其它相關(guān)基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

以往研究顯示腦缺血后促凋亡蛋白 Bax表達(dá)明顯增加,且Bax陽性反應(yīng)位于 TUNEL陽性的細(xì)胞內(nèi),其時(shí)程與空間的分布與 TUNEL陽性神經(jīng)元一致[5]。Bcl-2/Bax比值的轉(zhuǎn)變,可能調(diào)控了神經(jīng)元的凋亡。研究表明,細(xì)胞受刺激后 Bcl-2/Bax的比值越高,細(xì)胞存活率越高,細(xì)胞凋亡率越低。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后,缺血再灌注組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目、Bcl-2/bax比值均明顯高于假手術(shù)組;Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾注射液對腦缺血再灌注具有很好的改善作用[6],降低凋亡率,升高 Bcl-2/bax比值。本研究顯示,康腦液Ⅰ號(hào)組可上調(diào)腦缺血再灌注誘導(dǎo)的 Bcl-2蛋白表達(dá),同時(shí)下調(diào) Bax蛋白表達(dá),使 Bcl-2/Bax比值升高,可能促使 Bax-Bcl-2異源二聚體形成,抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)康腦液Ⅰ號(hào)治療后,梗死灶明顯減小,腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少,Bcl-2/Bax比值明顯高于缺血再灌注組,說明康腦液Ⅰ號(hào)可能通過抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡,達(dá)到保護(hù)缺血半暗帶目的,從而起到保護(hù)大鼠局灶性腦缺血再灌注的作用。

目前,關(guān)于中藥復(fù)方治療中風(fēng)的研究進(jìn)展迅速,藥理研究證實(shí)康腦液Ⅰ號(hào)組方中單藥如黃芪、三七、葛根等具有擴(kuò)張血管、改善腦血流、改善微循環(huán)、降低血液粘度、降低血脂、抑制炎性反應(yīng)等作用[7]。我們選擇方劑康腦液Ⅰ號(hào)為臨床治療缺血性腦血管病的經(jīng)驗(yàn)組方,以黃芪為君藥,三七、葛根、天麻、川芎共為臣藥 ,佐以鉤藤、地龍,同時(shí)川芎、地龍又具引藥之性 ,二藥輕清引上 ,直達(dá)病所。黃芪益氣升陽,三七活血止血,鉤藤熄風(fēng)鎮(zhèn)驚,地龍清熱利濕 ,天麻、川芎定風(fēng),可能對腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)、再生作用機(jī)制產(chǎn)生多水平、多通道、多靶點(diǎn)的綜合效應(yīng)。

綜上所述,康腦液Ⅰ號(hào)可明顯減少 M CAO模型大鼠缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與提高 Bcl-2/Bax比值有關(guān),可能是其促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)及重塑的機(jī)制之一。為臨床應(yīng)用康腦液Ⅰ號(hào)治療缺血性腦血管疾病提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversible middle Cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]Ferrer I,Planas AM.Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia: life and death struggle in the penumbra.Neuropathol Exp Neurol,2003,62:328-339.

[3]O ltvai ZN,Milliman CL,Korsm eyer S J.Bcl-2 heterodinerizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerates programmed cell death[J].Cell,1993,74(4):609-619.

[4]金 華,孫 抒,于柏艷,等.蠐螬提取物對 MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2008,24(1):93-96.

[5]Cao G,Minami M,Pei W,et al.Intracellular Bax translocation after transient cerebral ischemia:implications for a role of the mitochondrial apoptotic signaling pathway in is chemic neuronal death[J].J Cereb Blood Flow Metab,2001,21(4):321.

[6]Satoh S, Ikegaki I, Suzuki Y, et al.Neuroprotective properties of a protein kinase inhibitor against ischemia-induced neuronal damage in rats and gerbils[J].Br J Pharmacol,1996,118(7):1592.

[7]李 花,鄧常清,陳北陽,等.三七總皂苷對大鼠腦缺血再灌注后 Caspase表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2006,22(2):189-193.