結(jié)直腸癌組織中MAC30的表達(dá)及其臨床意義

趙增仁，張麗靜，張志勇，張學(xué)明，胡月明，李芳，孫曉峰

（1.河北醫(yī)科大學(xué) 第一醫(yī)院普外科，石家莊 050031；2.唐山市工人醫(yī)院 病理科，河北 唐山 063000）

腦膜瘤相關(guān)蛋白（meningioma-associated protein，MAC30）首先發(fā)現(xiàn)在腦膜瘤中呈過(guò)度表達(dá)［1］，隨后發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌中表達(dá)也上調(diào)，但在胰腺癌中表達(dá)減少或缺失［2］。我們采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MAC30蛋白在結(jié)直腸癌組織、正常黏膜及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)結(jié)直腸癌及正常黏膜中MAC30mRNA的表達(dá)，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特征間的關(guān)系，探討MAC30在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集唐山市工人醫(yī)院2007年1月至2008年12月的結(jié)直腸癌石蠟存檔蠟塊共130例，包括對(duì)應(yīng)病例的正常黏膜組織73例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織34例。收集2007年10月至2009年1月50例來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院、唐山市工人醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本。每例標(biāo)本分別取自結(jié)直腸原發(fā)腫瘤組織、距腫瘤2 cm的無(wú)瘤黏膜組織、近端和遠(yuǎn)端切緣正常黏膜組織（直腸癌無(wú)遠(yuǎn)端切緣黏膜）。新鮮標(biāo)本離體后迅速置于液氮中，于-80℃保存。所有患者術(shù)前未接受任何化療和放療。年齡31～90歲，平均57.6歲。其中男性31例，女性19例；≤60歲30例，>60歲20例；中高分化41例，低分化9例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。

1.2 主要試劑

鼠抗人MAC30單克隆抗體由孫曉峰教授饋贈(zèng)，S-P免疫組化試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）、Trizol試劑（Invirotrogen）、cDNA第一鏈合成試劑盒（Fermentas）、TaqDNA 聚合酶（Promega）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定：采用S-P兩步法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。MAC30染色陽(yáng)性物質(zhì)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)），按切片中細(xì)胞著色深淺評(píng)分：細(xì)胞無(wú)顯色為-，淺黃色為+，棕黃色為++，棕褐色為+++。

1.3.2 結(jié)直腸癌組織MAC30mRNA表達(dá)測(cè)定：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR），按照試劑盒說(shuō)明提取組織中的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增MAC30及β-actin基因片段。MAC30引物序列，上游：5′ACTGCTCAGAACCCACGTCT 3′，下游：5′ATCATGCCACTGCCCTTTAC 3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為 168 bp；β-actin 引物序列，上游：5′GGAAATCGTGCGTGACATTA 3′，下游：5′GGAGCAATGATCTTGATCTTC 3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為379 bp；引物由北京塞百盛生物有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為：cDNA 2 μl，TaqDNA 聚合酶 0.125 μl，上下游引物各 10 pmol，10 mmol/L dNTPs 1 μl，補(bǔ) DEPC 處理過(guò)的水至終體積 25 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μl置2%瓊脂糖凝膠電泳、采用凝膠成像及圖像分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析。根據(jù)MAC30與β-actin條帶灰度比半定量分析MAC30mRNA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、方差分析。MAC30表達(dá)和生存期之間的關(guān)系采用Cox回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAC30在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)

MAC30在結(jié)腸正常黏膜組織中表達(dá)較弱，其表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性率為11%（8/73）；結(jié)直腸癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中MAC30染色較強(qiáng)，130例結(jié)直腸癌組織中MAC30表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性率為48%（62/130），轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中為65%（22/34）；結(jié)直腸癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中MAC30的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常黏膜（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

2.2 MAC30mRNA在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)

MAC30mRNA在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)（0.57±0.36）較癌旁無(wú)瘤黏膜（0.35±0.25）、近端（0.34±0.25）及遠(yuǎn)端正常黏膜（0.35±0.28）的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；癌旁無(wú)瘤黏膜、近端及遠(yuǎn)端正常黏膜中MAC30mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差別（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 結(jié)直腸癌組織中MAC30mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

在黏液癌/印戒細(xì)胞癌中MAC30mRNA的表達(dá)水平（0.80±0.40）較非粘液癌（0.48±0.29）明顯增高（P＜0.01）。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)AC30mRNA的表達(dá)水平較不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.4 MAC30mRNA的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存期的關(guān)系

對(duì)結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存期進(jìn)行評(píng)估，以中位數(shù)為界，將其分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組。結(jié)直腸癌中MAC30mRNA高表達(dá)的患者3年生存率明顯低于MAC30弱表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

MAC30位于染色體 17q11.2，1993年 Murphy等［1］發(fā)現(xiàn)該蛋白在腦膜瘤中高表達(dá)，因此而命名。2004年Kayed等首次發(fā)現(xiàn)MAC30在正常結(jié)腸、胃、食管及胰腺組織中均有表達(dá)。MAC30mRNA及蛋白在人多種腫瘤中表達(dá)水平不同，如：在胰腺癌和腎癌中低表達(dá)，在卵巢癌、食道癌、胃癌和結(jié)腸癌中高表達(dá)［2］。在一項(xiàng)前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)直腸癌患者無(wú)論術(shù)前是否曾接受放療，MAC30蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，并且在浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的腫瘤中其表達(dá)也增加［3］。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從遠(yuǎn)端正常結(jié)腸黏膜→原發(fā)癌組織→淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，MAC30蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在原發(fā)癌組織中表達(dá)顯著高于正常黏膜。同時(shí)，MAC30mRNA在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)較癌旁無(wú)瘤黏膜、近端及遠(yuǎn)端正常黏膜的表達(dá)明顯增強(qiáng)，與MAC30蛋白表達(dá)一致，表明MAC30mRNA在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起一定的促進(jìn)作用。

表1 MAC30mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）Tab.1 Relationship ofMAC30mRNA expression in primary tumor with clinicopathologic features（±s）

表1 MAC30mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）Tab.1 Relationship ofMAC30mRNA expression in primary tumor with clinicopathologic features（±s）

Variables n MAC30mRNA expression tvalue P-value Histology -2.739 0.009 Non-mucinous 40 0.48±0.29 Mucinous/signet-ring cell 10 0.80±0.40 Differentiation 0.561 0.578 Better/moderate 41 0.55±0.35 Worse 9 0.47±0.26 Lymph nodes metastasis－0.616 0.541 No 27 0.48±0.24 Yes 23 0.52±0.26

另外，MAC30mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)上調(diào)與腫瘤的組織學(xué)類型密切相關(guān)，黏液/印戒細(xì)胞癌中MAC30mRNA的表達(dá)較非黏液性腺癌的表達(dá)水平明顯增高，這可能解釋了為什么MAC30的表達(dá)和患者預(yù)后有關(guān)。目前許多證據(jù)表明，結(jié)直腸黏液癌/印戒細(xì)胞癌病人預(yù)后較非黏液癌病人更差［4，5］，黏蛋白可能通過(guò)分泌唾液酸殘?jiān)诒慰乖砦欢蓴_腫瘤細(xì)胞的免疫識(shí)別和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。隨后，我們對(duì)患者生存期進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MAC30mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平和患者的3年生存期密切相關(guān)，MAC30mRNA高表達(dá)的患者3年生存率較低。這證實(shí)MAC30mRNA的表達(dá)上調(diào)和結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，MAC30的高表達(dá)可作為評(píng)估患者臨床預(yù)后的一項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)。

MAC30的高表達(dá)和腫瘤的組織學(xué)類型及患者預(yù)后不良有關(guān)，提示MAC30在結(jié)直腸癌進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，故我們推測(cè)MAC30可以作為腫瘤診斷、惡性進(jìn)展及預(yù)后判斷的有效指標(biāo)，并可能為結(jié)直腸癌的基因治療提供有效靶點(diǎn)。

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