吲哚美辛、組胺-吲哚美辛對鼠Lewis肺癌凋亡誘導作用的實驗研究

王東，張彩霞

（中國醫(yī)科大學 盛京醫(yī)院核醫(yī)學科，沈陽 110004）

原發(fā)性支氣管肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一。肺腺癌在原發(fā)性支氣管肺癌中極為常見，傳統(tǒng)化療和放療對肺腺癌效果均不甚理想［1］，而且其創(chuàng)傷大、不良反應多、患者耐受力差及經(jīng)濟等問題都極大限制了其臨床應用。本實驗通過吲哚美辛（indomethacin，IN）、 組 胺 -吲 哚 美 辛（histamin-indomethacin，his-IN）對Lewis肺癌荷瘤小鼠治療的研究，探討其在抗腫瘤方面的作用。

1 材料與方法

1.1 動物

鼠Lewis肺癌瘤株引自中國醫(yī)學科學院藥物研究所。昆明小鼠鼠齡6～8周，體質(zhì)量（20±2）g，雄性，購于中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院實驗動物中心。二甲基亞砜（DMSO）購自沈陽市化工二廠。

1.2 主要試劑及儀器

IN由山西云鵬藥業(yè)藥廠提供，純度98.5%；his-IN純度＞95%，為本研究組委托沈陽藥科大學協(xié)助合成；TNF-α放射免疫分析藥盒購于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司；SE型Facsvantage流式細胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）美國 Becton Dickinson公司產(chǎn)品，由中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院中心試驗室提供。

1.3 鼠Lewis肺癌模型制備及分組

將Lewis肺癌荷瘤模型鼠處死，取生長良好的腫瘤組織5 g用研磨器磨碎，加生理鹽水15 ml稀釋成細胞懸液。用注射器接種每只0.2 ml細胞懸液，接種于30只昆明小鼠右前肢腋部皮下，待腫瘤長徑達1.0 cm左右，將30只Lewis肺癌荷瘤小鼠隨機分為5組，每組均為6只，生理鹽水對照組，IN分為3.0 mg/kg及3.5 mg/kg治療組，his-IN分為3.0 mg/kg及3.5 mg/kg治療組，均采用灌胃法，隔日按劑量給藥，連續(xù)觀察10 d。

1.4 IN抑瘤實驗

每次給藥前用游標卡尺測量腫瘤長徑（a）、短徑（b），并按公式V＝1/2·ab2計算腫瘤體積。分別取鼠血1 ml，離心后留血清置于-20℃冰箱中保存。灌胃10 d治療結(jié)束后以頸椎脫位法處死小鼠，取出完整腫瘤組織稱重。按體積法計算各組抑瘤率：抑瘤率（%）＝（1-實驗組平均體積/對照組平均體積）×100。

1.5 FCM檢測細胞凋亡峰及凋亡率

各組治療后分別處死Lewis肺癌荷瘤小鼠，取瘤組織、稱質(zhì)量，生理鹽水沖洗；于200目不銹鋼濾網(wǎng)上加2 ml生理鹽水研磨，形成單細胞懸液，待測細胞濃度為（5×105～5×106）/ml；取 1 ml細胞，1 000 r/min，4 ℃離心 10 min，棄上清；加入 1 ml冷 PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清（重復2次）；將細胞重懸于200 μl Binding Buffer，；加入 10 μl Annexin Ⅴ-FITC 和 10 μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min或4℃反應30 min；加入300 μl Binding Buffer，在1 h內(nèi)上機檢測。FCM用碘化丙錠（PI）染色后分析，可在二倍體G0/G1，峰前出現(xiàn)“亞二倍體”峰，即細胞凋亡峰（APO峰），根據(jù)APO峰可測出凋亡細胞百分率［2］，其熒光信號經(jīng)流式細胞儀Multicycle細胞周期分析軟件處理后以直方圖和數(shù)據(jù)表方式在熒光屏上顯示。

1.6 放免法測定TNF-α含量

將事先放在-20℃冰箱中保存的血清取出，與125I-TNF-α放射免疫分析藥盒中提供的校準品依次加入試管中，標記物、抗體等試劑按程序規(guī)定分別加入對應的試管中，充分混勻，放置于4℃冰箱中24 h后，加入分離劑、充分混勻、室溫放置15 min，離心前任取兩管測量總放射性T，3 500 r/min離心20 min，棄上清液，測量各管放射性計數(shù)。在logit-Log坐標紙上繪制標準曲線，根據(jù)樣品B/B0%，依標準曲線查出樣品的含量。1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 抑瘤率

his-IN及IN治療各組與對照組Lewis肺癌荷瘤小鼠在治療過程中腫瘤體積變化，見圖1。治療各組腫瘤體積增長緩慢，治療10 d后各治療組的抑瘤率與對照組比較，腫瘤生長均受到明顯抑制（P＜0.05），各治療組的抑瘤率分別為IN 3.0 mg/kg組38.56%、IN 3.5 mg/kg組52.25%、his-IN 3.0 mg/kg組57.62%和his-IN 3.5 mg/kg組79.21%，各治療組均有不同程度抑制Lewis肺癌的生長，治療組與對照組瘤重有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 FCM檢測細胞凋亡峰及凋亡率

AnnexinⅤ-FITC加PI雙標法發(fā)現(xiàn)：在雙變量FCM的散點圖上可以看出，不同治療組的Lewis肺癌荷瘤小鼠右下象限（FITC+/PI-）可見大量細胞，即凋亡細胞，尤以3.5 mg/kg his-IN組明顯，如圖2所示；不同治療組與對照組的凋亡率（%）詳見表1。PI單標法行流式細胞儀檢測不同治療組均可在G0/G1峰期前出現(xiàn)明顯的“亞二倍體峰”，即APO峰，而生理鹽水對照治療組未見明顯凋亡峰；his-IN組或IN組隨劑量的增加，凋亡峰出現(xiàn)更明顯，其中3.5 mg/kg his-IN組凋亡峰出現(xiàn)最明顯，見圖3。

2.3 放免法測定

各組Lewis肺癌荷瘤小鼠的血清中TNF-α的含量在治療前基本相近，治療后TNF-α的含量均升高，給藥治療10 d后TNF-α含量詳見表1。治療后各組TNF-α的含量與生理鹽水對照組均有顯著性差異（P<0.05）。

表1 不同治療組的細胞凋亡率和TNF-α的含量比較（±s）Tab.1 Comparison of the apoptosis rate and TNF-α content in different groups（±s）

表1 不同治療組的細胞凋亡率和TNF-α的含量比較（±s）Tab.1 Comparison of the apoptosis rate and TNF-α content in different groups（±s）

Content of TNF-α Before treatment After treatment Control 6 10.30±3.45 0.58±0.26 0.71±0.24 3.0 mg/kg IN 6 29.58±2.53 0.61±0.29 1.03±0.36 3.5 mg/kg IN 6 42.41±1.94 0.65±0.31 1.35±0.42 3.0 mg/kg his-IN 6 41.24±1.86 0.62±0.25 1.39±0.44 3.5 mg/kg his-IN 6 51.69±0.68 0.59±0.27 2.11±1.13 Group n Apoptosis rate（%）

3 討論

對腫瘤發(fā)病機制和治療藥物的研究是一項重要的科學探索課題。腫瘤細胞的惡性增生和轉(zhuǎn)移是破壞機體完整性的原因之一，而癌癥的化療和放療都是通過誘導腫瘤細胞的凋亡得以實現(xiàn)的［3］。因此，腫瘤細胞凋亡的檢測特別是在活體動物體內(nèi)的檢測成為目前國內(nèi)外的研究熱點［4］。

細胞凋亡［5］作為細胞死亡的主要形式，可清除機體受損細胞，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。細胞凋亡是一種由多基因調(diào)控的細胞自主的死亡過程，又稱程序性死亡，是一種受控于基因指導的主動性細胞自我消亡過程，是細胞固有的功能，其形態(tài)特征包括細胞固縮、染色質(zhì)凝聚邊集至核膜下以及凋亡小體形成［6］。當前普遍認為各種化療藥物無論藥物的靶點在哪，最終主要通過誘導腫瘤細胞凋亡或壞死而達到治療目的［7］。如何提高腫瘤細胞凋亡率、降低增殖速度、防止殺傷正常組織，是腫瘤治療的方向。臨床上可將腫瘤細胞凋亡作為評估化療效果的一項指標。Wei等［8］給昆明鼠接種H22肝癌細胞，每日喂服IN，21 d后用流式細胞儀檢測，H22細胞出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰。通過流式細胞儀對胃癌凋亡峰的測定，可見典型的亞二倍體凋亡峰。Zhang等［9］將IN加入化療藥物足葉乙甙（Vp-16）中共同作用于慢性髓細胞白血?。–ML），發(fā)現(xiàn)IN可發(fā)揮協(xié)同效應，提高Vp-16的誘導凋亡作用。

腫瘤壞死因子是一個多功能細胞因子，由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，為一種多功能蛋白，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體代謝及誘導細胞分化，它對腫瘤細胞有直接殺傷作用，在體內(nèi)可通過對腫瘤血管的促凝作用，而使腫瘤缺血壞死。近期有研究證明，TNF-α可抑制某些腫瘤細胞的增殖及誘導腫瘤細胞凋亡［10］，IN與化療同時應用，治療后血清TNF-α水平升高，可直接殺傷腫瘤細胞［11］。IN具有調(diào)整機體免疫狀態(tài)，刺激機體產(chǎn)生TNF、IL-2和INF等因子，因而具有直接抗腫瘤和輔助抗腫瘤作用［12］，能協(xié)同提高TNF和IL-2抗腫瘤療效。TNF-α與肺癌的預后和復發(fā)有關(guān)，血中TNF-α含量可反映機體抗腫瘤免疫狀態(tài)，TNF-α水平升高可能有益于調(diào)動自身抗癌能力［13］。流式細胞術(shù)還可以通過測定位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）在細胞凋亡時轉(zhuǎn)至細胞膜外表面來檢測細胞凋亡。膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高度親和力，熒光標記的膜聯(lián)蛋白V與細胞表面PS結(jié)合，再用FCM進行檢測，可以觀察凋亡過程中細胞膜PS的表面化，結(jié)合PI染色進行雙參數(shù)檢測可區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞及壞死細胞［13］。檢測發(fā)現(xiàn)：不同治療組的凋亡率分別為3.0 mg/kg his-IN 組凋亡率為（41.24±1.86）%；3.5 mg/kg his-IN 組凋亡率為（51.69±0.68）%；3.0 mg/kg IN組凋亡率為（29.58±2.53）%；3.5 mg/kg組凋亡率約為（42.41±1.94）%，生理鹽水對照組凋亡率約為10.3%；不同治療組均可在G0/G1峰期前出現(xiàn)明顯的“亞二倍體峰”及APO峰，而用生理鹽水對照組未見確切的凋亡峰；his-IN組及IN組隨劑量的增加，凋亡峰明顯，其中3.5 mg/kg組凋亡峰最明顯，其結(jié)果表明：his-IN及IN均有明顯的誘導細胞凋亡的作用，其中3.5 mg/kg his-IN組最高。結(jié)果顯示IN和his-IN可通過誘導細胞凋亡作用，來發(fā)揮抗腫瘤的作用。

本實驗應用放免方法測得各治療組TNF-α的含量：獲得荷瘤鼠IN組與his-IN組不同劑量治療組的血清TNF-α的含量較治療前均明顯升高；尤其高劑量his-IN組TNF-α含量較其低劑量組明顯升高，IN高劑量治療組TNF-α含量高于低劑量治療組，可見TNF-α含量呈劑量依賴型；3.5 mg/kg his-IN組與其他各治療組相比TNF-α含量有顯著性差異（P＜0.05），可見his-IN也可能是通過促進TNF-α的釋放來間接發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，本試驗通過每日對荷瘤鼠腫瘤的體積及質(zhì)量的測量可見：不同治療組的腫瘤體積及質(zhì)量都較治療前明顯縮小，抑瘤率都明顯提高；3.5 mg/kg his-IN組的抑瘤率最為顯著，與其他治療組比較亦有顯著性差異（P＜0.05）；3.0mg/kg his-IN組與3.5 mg/kg IN組抑瘤率基本接近，無顯著性差異（P＞0.05）。提示his-IN及IN對腫瘤可產(chǎn)生直接抑制作用，且高劑量的his-IN組抑瘤效果更明顯。

本研究國內(nèi)外首次合成his-IN，并將其用于動物實驗，發(fā)現(xiàn)his-IN、IN有明顯地誘導腫瘤細胞凋亡的作用，尤其his-IN的高劑量更為明顯，his-IN、IN的誘導腫瘤細胞凋亡的作用，為臨床腫瘤的治療提供了更重要的理論基礎(chǔ)。

［1］El-Sharouni SY，Kal HB，Battermann JJ.Sequential versus concurrent chemoradiotherapy in inoperable stageⅢnon-small cell lung cancer［J］.Anticancer Res，2006，26（1B）：495-505.

［2］Elsteinkh，Zucker RM.Comparison of cellular and nuclear flow-cytometric techniques for diseriminating apoptotic subpopulations［J］.Exp Cell Res，1994，211（2）：322-331.

［3］Kerr JF，Winterford CM，Harmon BV.Apoptosis：Its significance in cancer and cancer therapy［J］.Cancer，1994，73（8）：2013-2026.

［4］Lahorte CM，Vanderheyden JL，Steinmetz N.Apoptosis-detecting radio ligands：current state of the art and future perspectives［J］.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2004，31：887-919.

［5］Vermes I，Haanen C，Steffens NH.A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidy secine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled annex-in V ［J］.J lmmunol Methods，1995，184（1）：39-42.

［6］Tamm I，Schriever F，Dorken B.Apoptosis：implications of basic research for clinical oncology［J］.Lancet Oncol，2001，2（1）：33-42.

［7］Sykiotis GP，Papavassiliou AG.Apoptosis：the suicide solution in cancer treatment and chemoprevention ［J］.Expert Opin Investig－Drugs，2006，15（6）：575-577.

［8］Wei J，Li X，Ren X.Non-steroidal anti-inflammatory drugs induce apoptosis in implanted hepatoma in mice ［J］.Chin J Pathophysiol，2000，19：1074-1078.

［9］Zhang G，Tu C，Zhang G.Indomethacin induces apoptosis and inhibits proliferation in chronic myeloid leukemia cells［J］.Leuk Res，2000，24：385-392.

［10］Rübe CE，van Valen F，Wifert F.Ewing′s sarcoma and peripheral primitive neuroectodermal tumor cells produce large quantities of bioactive tumor necrosis factor-α （TNF-α）after radiation exposure［J］.Int J Radiat Oncol Bio Phys，2003，56：1414-1425.

［11］Kim CD，Sung MW，Lee SJ.The effect of prosta gland in and its inhibitor on antibody-dependent cellular cytoxicity against human squamous cell carcinoma of head and neck ［J］.Anticancer Res，1999，19（1A）：455-459.

［12］Xu QX，Xu FZ，Liu C.Clinic significance of detection tumor necrosis factor alpha in patients with lung cancer［J］.Chin J Clin On col Rehabil，2002，9（4）：38-39.

［13］Chong HZ，Zhao HA，Aruna S.A mitochondral membraneprotein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apoptosis cells［J］.J Immunol，1996，157（9）：3980-3987.