胃癌細(xì)胞對三氧化二砷的敏感性與活性氧產(chǎn)生的關(guān)系

張敬東，佟曉光，劉云鵬，侯科佐，于萍，曲秀娟

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 1.腫瘤內(nèi)科；2.婦科，沈陽 110001）

砷劑的藥物學(xué)作用在祖國醫(yī)學(xué)中已有悠久的歷史，我國學(xué)者應(yīng)用三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）治療初治與復(fù)發(fā)的急性早幼粒細(xì)胞白血病，患者達(dá)到完全緩解［1］，取得良好的療效，同時(shí)無明顯的不良反應(yīng)及輕微骨髓抑制。低濃度砷劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生有關(guān)［2，3］。本研究通過 As2O3作用 3種不同的胃癌細(xì)胞系，研究不同胃癌細(xì)胞系對As2O3的敏感性差異與細(xì)胞內(nèi)在的ROS水平及ROS水平變化之間的關(guān)系，探討As2O3對胃癌細(xì)胞系的殺傷與ROS的關(guān)系，為As2O3的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑：0.1%的As2O3，哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、2′，7′-二氯乙酰乙酸鹽熒光素（DCFH-DA），購于DAKO公司。DCFHDA，用95%乙醇溶解濃度為5 mmol/L，避光4℃保存，使用前用PBS稀釋成終濃度10 μmol/L。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

低分化胃黏液腺癌細(xì)胞株MGC803和BGC823、中分化腺癌細(xì)胞株SGC7901為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代培養(yǎng)，均生長于含有10%熱滅活胎牛血清、12 U/ml慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用終濃度0.25%的胰酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 MTT法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔平底培養(yǎng)板，培養(yǎng)12h后加入0.1，0.5，2，5，10，25，50 μmol/L 的 As2O3，設(shè)立空白對照，每組取3個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)孵育24，48，72 h后每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，再培養(yǎng)4 h后吸去全部上清液，每孔加入DMSO 200 μl，振蕩搖勻。置酶標(biāo)儀上于570 nm波長下測吸光度，按下列公式計(jì)算增殖率：增殖率=（處理組平均吸光度值-空白對照平均吸光度值）/（對照組平均吸光度值-空白對照平均吸光度值）×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平

取對照及 5 μmol/L As2O3作用 24 h的胃癌MGC803、BGC823和 SGC7901細(xì)胞，用 PBS洗 2次，1 000 r/min離心5 min，去上清，每管加入10 μmol/L的DCFH-DA 1 ml。37℃避光恒溫水浴40 min，1 000 r/min離心10 min，去上清后加PBS 500 μl，用流式細(xì)胞儀測定DCFH-DA被細(xì)胞內(nèi)H2O2氧化為 2′，7′-二氯熒光素 （2′，7′-dichlorofluorescein，DCF），DCF能發(fā)出綠色熒光，其熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞內(nèi)ROS的總體生成水平［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 As2O3抑制胃癌細(xì)胞系的增殖

不同濃度的 As2O3作用于胃癌 MGC803、BGC823和SGC7901細(xì)胞24～72 h，結(jié)果顯示As2O3呈時(shí)間、濃度依賴性抑制3種胃癌細(xì)胞的增殖，72 h抑制細(xì)胞增殖的IC50分別為2.8，3.1和10.2 μmol/L，與對照組比較均有顯著差異（P<0.01）。胃癌MGC803和BGC823細(xì)胞72 h的IC50均明顯低于SGC7901細(xì)胞（P均<0.01）。見圖1。

2.2 細(xì)胞內(nèi)在ROS的水平

MGC803、BGC823和SGC7901細(xì)胞在未用藥時(shí)ROS 峰值水平分別為 20.3±2.0、64.2±3.3 和 57.7±2.0（圖2）。BGC823細(xì)胞未用藥時(shí)的內(nèi)在ROS水平最高，SGC7901次之，MGC803細(xì)胞最低，而胃癌MGC803、BGC823細(xì)胞對As2O3的敏感性均明顯高于SGC7901細(xì)胞，內(nèi)在ROS的水平不能反映胃癌細(xì)胞對As2O3的敏感性。

2.3 As2O3作用后細(xì)胞ROS產(chǎn)生的變化

5 μmol/L As2O3作用 24 h 后，MGC803、BGC823和SGC7901細(xì)胞內(nèi)ROS峰值水平分別為100.8±3.8、103.5 ±2.3 和 56.5 ±2.4，MGC803、BGC823 細(xì) 胞 的ROS峰值水平與用藥前比較明顯增高（P<0.001，P<0.01），而SGC7901細(xì)胞未見明顯的升高峰（P>0.05）。而3種細(xì)胞系中SGC7901細(xì)胞72 h的IC50是其他2種細(xì)胞的3～4倍，對As2O3的敏感性低于其他2種胃癌細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞對As2O3的敏感性與As2O3作用后ROS的升高有關(guān)。見圖3。

3 討論

As2O3對初治及復(fù)發(fā)的急性早幼粒細(xì)胞白血病具有較好的療效［1］，體外實(shí)驗(yàn)表明As2O3同時(shí)對多種實(shí)體瘤細(xì)胞均有殺傷作用，主要機(jī)制為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［2，3，5～7］。近年來研究表明，多種抗腫瘤藥等被證實(shí)通過 ROS 產(chǎn)生引起凋亡［2，3，8～10］。ROS 是真核細(xì)胞有氧呼吸過程中形成的，它包括H2O2、超氧陰離子（O2-）、羥自由基（OH）、一氧化氮（NO）等，其中H2O2具有較強(qiáng)的氧化性，是ROS的主要成分之一，可以反映總體ROS水平。

As2O3作為新的凋亡誘導(dǎo)劑，有文獻(xiàn)報(bào)道主要通過ROS 的產(chǎn)生，尤其是 H2O2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［3，8～10］。也有文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤細(xì)胞對As2O3的敏感性與細(xì)胞內(nèi)在固有ROS水平有關(guān)［11］。As2O3誘導(dǎo)消化道腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制與線粒體膜電位降低、ROS產(chǎn)生有關(guān)，腫瘤細(xì)胞對As2O3殺傷的敏感性與ROS的關(guān)系仍不清楚。

本研究對3種胃癌細(xì)胞系進(jìn)行比較研究，結(jié)果顯示As2O3對3種胃癌細(xì)胞系均有殺傷作用，但MGC803和BGC823細(xì)胞對As2O3的敏感性明顯高于SGC7901細(xì)胞。而內(nèi)在ROS水平以BGC823細(xì)胞最高，SGC7901細(xì)胞次之，MGC803細(xì)胞最低，因此胃癌細(xì)胞對As2O3的敏感性與內(nèi)在ROS水平無明顯相關(guān)性。而Yi等［11］應(yīng)用兩對4種細(xì)胞系進(jìn)行兩兩比較，認(rèn)為As2O3的敏感性與細(xì)胞內(nèi)在ROS水平相關(guān)，與我們的研究結(jié)果不同，可能與選擇的細(xì)胞系的種類及數(shù)量不同有關(guān)。我們應(yīng)用3種胃癌細(xì)胞系比較不同細(xì)胞系間的差別。在As2O3作用24 h后MGC803和BGC823細(xì)胞的ROS水平均有明顯升高，而SGC7901細(xì)胞未見升高，胃癌細(xì)胞對As2O3的敏感性可能與ROS的產(chǎn)生有關(guān)，提高細(xì)胞內(nèi)ROS的水平能夠增加As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化可能與細(xì)胞對As2O3的敏感性更相關(guān)［3，8～10］。

本研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞系對As2O3的敏感性與ROS的變化程度有關(guān)，與內(nèi)在ROS水平無明顯相關(guān)，為As2O3的臨床應(yīng)用提供了參考。

［1］Chen GQ，Zhu J，Shi XG，et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanism of arsenic trioxide（As2O3）in the treatment of acute promyelocytic leukemia：As2O3induces NB4 cell apoptosis with down regulation of Bcl-2 expression and modulation of PML/RARα/PML proteins［J］.Blood，1996，88（3）：1052-1061.

［2］Woo SH，Park IC，Park MJ，et al.Arsenic trioxide induces apoptosis through a reactive oxygen species-dependent pathway and loss of mitochondrial membrane potential in HeLa cells ［J］.Int J Oncol，2002，21（1）：57-63.

［3］曹娟，鄭杰.As2O3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡依賴H2O2途徑［J］.中國病理生理雜志，2006，22（6）：1185-1190.

［4］Ischiropoulos H，Gow A，Thom SR，et al.Detection of reactive nitrogen species using 2，7-dichlorodihydrofluorescein and dihydrorhodamine 123［J］.MethodsEnzymol，1999，301：367-373.

［5］Zhang TC，Cao HE，Li JF，et al.Induction of apoptosis and inhibition of human gastric cancer MGC803 cell growth by arsenic trioxide［J］.Eur J Cancer，1999，35（8）：1258-1263.

［6］Li Y，Qu X，Qu J，et al.Arsenic trioxide induces apoptosis and G2/M phase arrest by inducing Cbl to inhibit PI3K/Akt signaling and thereby regulate p53 activation［J］.Cancer Lett，2009，84（2）：208-215.

［7］張敬東，佟曉光，劉云鵬.三氧化二砷誘導(dǎo)卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞周期阻滯及凋亡［J］.腫瘤，2003，23（4）：294-296.

［8］Doudican NA，Bowling B，Orlow SJ.Enhancement of arsenic trioxide cytotoxicity by dietary isothiocyanates in human leukemic cells via a reactive oxygen species-dependent mechanism［J］.Leuk Res，2010，34（2）：229-234.

［9］Cha Y，Park DW，Lee CH，et al.Arsenic trioxide induces apoptosis in human colorectal adenocarcinoma HT-29 cells through ROS［J］.Cancer Res Treat，2006，38（1）：54-60.

［10］Yi J，Yang J，He R，et al.Emodin enhances arsenic trioxide-induced apoptosis via generation of reactive oxygen species and inhibition of survival signaling［J］.Cancer Res，2004，64（1）：108-116.

［11］Yi J，Gao F，Shi G，et al.Apoptosis susceptibility of tumor cells to arsenic trioxide and the inherent cellular level of reactive oxygen species［J］.Chin Med J（Engl），2002，115（4）：603-606.