bFGF復合骨基質明膠在兔股前區(qū)促血管化作用

單偉，秦書儉

（遼寧醫(yī)學院 解剖學教研室，遼寧 錦州 121001）

目前，促進組織工程骨血管化的主要研究方向是：（1）血管網(wǎng)包裹術；（2）組織工程化預構骨瓣；（3）血管內皮細胞復合；（4）血管束植入技術；（5）生長因子摻入［1］。要實現(xiàn)組織工程骨的血管化，必須還要有促血管生成因子的存在，骨折局部雖然有促血管生長因子的聚集，但加入外源性的生長因子可能會加快組織工程骨的血管化，從而加速骨折愈合。關于外源性生長因子和血管束植入相結合促進血管化的研究國內外還未見報道。成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF） 是目前實驗中常用的促血管生長因子之一，它不僅可以促進內皮細胞的生長和血管的形成，而且還可以誘導外周的內皮細胞前體到移植區(qū)，具有很強的促血管新生能力，在傷口愈合和組織修復中發(fā)揮重要作用。因此，本實驗旨在探討bFGF對骨基質明膠（bone matrix gelatin，BMG），包埋血管束在兔股前內側區(qū)的促血管化作用，為組織工程骨的血管化研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

健康5月齡日本大耳白兔40只，體質量1.5～2.0 kg，雌雄不限，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供（醫(yī)動字第 SCXY（遼）2003-2007號）。bFGF（美國Sigma公司）、墨汁（北京）、Masson三色染色試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMG的制備：

將4只日本大耳白兔用10%水合氯醛腹腔麻醉過量致死后取四肢骨、髂骨，去除軟組織。四肢骨的骨干及骨髓，用大量蒸餾水清洗，參照Urist［2］的方法將四肢骨和髂骨制備成6 mm×4 mm×3 mm大小的BMG。

1.2.2 實驗動物分組及BMG的植入：

將36只日本大耳白兔隨機分為A、B、C 3大組，每組12只。A組：bFGF+血管束+BMG；B組：血管束+BMG；C組：BMG。每大組按照術后觀察4周、8周、12周又分為3個小組，每小組4只。實驗動物用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔麻醉，無菌條件下手術，于股骨前內側膝關節(jié)上方做一縱行切口，A組：分離隱動脈（股動脈分支）及其伴行靜脈隱靜脈，將隱動、靜脈游離1 cm后順行植入用2 μg/ml bFGF浸泡過的BMG的凹槽內；B組：分離隱動、靜脈，將隱動、靜脈游離1 cm后順行植入未處理過的BMG的凹槽內；C組則直接將未處理過的BMG植入，不必分離隱動、靜脈。最后將移植區(qū)作嚴密、逐層縫合，關閉手術切口。術后5 d每日用4萬U慶大霉素肌內注射預防感染。

1.2.3 墨汁灌注及取材：

分別于手術后4周、8周、12周取各組動物，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉后固定，在下腹部縱行切開皮膚、皮下組織，游離腹主動脈、下腔靜脈，在腹主動脈離心插管，剪開下腔靜脈，放血至動物循環(huán)停止，同時向動脈內注入大量肝素生理鹽水（每500 ml生理鹽水中加入肝素12500 U）沖洗血管，直至靜脈遠端流出無色液體時為止，然后從腹主動脈注入配好的復合墨汁（墨汁、甲醛及生理鹽水體積比為3∶1∶6），遠端皮膚、趾甲均已變黑時結扎下腔靜脈遠端和近端開口，繼續(xù)灌入少量復合墨汁，當阻力增大肢體飽脹難以注入時停止，結扎動脈保持血管內壓力。低溫放置24 h后取出植入物置入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.2.4 透明標本的制作及觀察：

取固定好的植入物，A、B、C 3個組每個時間點各取2塊，按照以下步驟制作透明標本：（1）脫鈣：將移植物放入 0.6 mol/L HCl脫鈣 3 d；（2）去酸：將脫鈣標本置于蒸餾水中浸泡3 d去酸，每日換水2～3次，然后在自來水下連續(xù)沖洗1 h；（3）漂白：將去酸標本用5%過氧化氫漂白1 d，再流水沖洗1 h；（4）脫水：將漂白后標本用濾紙吸干，然后依次將其置于50%、60%、70%、80%、95%乙醇和無水乙醇逐級脫水各2 d；（5）透明和保存：將標本放于二甲苯中半透明7～14 d，最后移入冬青油中透明、保存。從中央縱向剖開用肉眼觀察移植物血管形成情況并攝像。

1.2.5 Masson染色組織學觀察及定量分析：

將剩余的固定好的植入物石蠟包埋、切片，厚度為5 μm，進行Masson染色，倒置顯微鏡下觀察血管化及成骨情況，攝像。以CIAS-1000細胞圖像分析系統(tǒng)測算其新骨面積比及血管面積比。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理所測得的數(shù)據(jù)，作多個樣本均數(shù)的兩兩比較，α＝0.05作為檢驗水準；同時作新生骨面積比和血管面積比的相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

所有實驗動物術后4～6 h蘇醒，并能站立進食。術后切口無感染，下肢無壞疽，傷口Ⅰ期愈合，均存活至完成試驗。

2.2 組織學觀察

術后4周，3組移植物邊緣均可見少量纖維結締組織和小血管形成，A組移植物中央有少量的血管，B組移植物中央血管較A組少。術后8周，3組移植物邊緣長入的纖維結締組織和小血管明顯增多，血管排列紊亂，A組移植物中央血管量增加，B組有少量血管，支架材料逐漸開始降解吸收，以A組降解吸收為最快，在血管周圍有新生軟骨組織形成，C組未見新骨形成。術后12周，A組材料已大部分被吸收，被新生軟骨和骨組織代替，位于其中的新生血管排列較有序（圖1），B組材料也大部分被吸收，被新生軟骨組織和骨組織代替，位于其中的新生血管逐漸趨向于有序排列（圖2），C組材料也有吸收，但仍由大量纖維結締組織充填，新生血管排列雜亂，主要集中于材料邊緣，中央較少（圖3）。

2.3 血管面積定量分析

移植物血管面積圖像分析結果見表1。從表中可以看出：4周，A組、B組、C組之間互相都有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；8周，A 組、B組、C 組之間互相有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；12周，A 組與 B、C 組差異有顯著性（P＜0.05）。而且各組中隨著時間的延長，移植物血管面積逐漸增加。

2.4 新生骨面積定量分析

移植物新生骨面積圖像分析結果見表2。從表中可以看出：4周，A、B組與C組之間都有顯著性差異（P＜0.05）；8周，A 組、B組、C 組之間互相都有顯著性差異（P＜0.05）；12周，A、B 組與 C組有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 移植物血管面積比比較（±s，%）Tab.1 Comparison of the ratio of neovascularization areas in the implant（±s，%）

表1 移植物血管面積比比較（±s，%）Tab.1 Comparison of the ratio of neovascularization areas in the implant（±s，%）

1）compared with group A，P<0.05；2）compared with group B，P<0.05；3）compared with group C，P<0.05.

Group 4 weeks 8 weeks 12 weeks A 2.24±0.042），3） 2.46±0.272），3） 4.58±0.032），3）B 0.82±0.081），3） 1.03±0.191），3） 2.52±0.131）C 0.18±0.021），2） 0.48±0.111），2） 1.25±0.101）

表2 移植物新生骨面積比比較（±s，%）Tab.2 Comparison of the ratio of osteogenic areas in the implant（±s，%）

表2 移植物新生骨面積比比較（±s，%）Tab.2 Comparison of the ratio of osteogenic areas in the implant（±s，%）

1）compared with group A，P<0.05；2）compared with group B，P<0.05；3）compared with group C，P<0.05.

Group 4 weeks 8 weeks 12 weeks A 15.29±1.103） 27.35±1.612），3） 21.62±1.033）B 14.44±1.363） 22.64±1.421），3） 21.3±1.143）C 5.73±1.251），2） 14.61±1.561），2） 11.86±0.561），2）

2.5 新生骨面積比與血管化面積比相關分析

新生骨面積與血管面積圖像分析結果見表3（γ4w=0.48，P ＜ 0.05；γ8w=0.52，P ＜ 0.05；γ12w=0.59，P＜0.05），新生骨面積比與血管面積比呈正相關。

3 討論

骨移植后的3個基本過程是移植物血管化、骨再生及骨端融合。血管化是關鍵環(huán)節(jié)，其作用貫穿于整個移植物修復過程，對骨再生與融合的方式及效果起決定作用［3～5］。長段骨干缺損之所以修復難度大，與其特定解剖部位血供來源相對薄弱有密切關系。在骨修復中，微血管的長入，即血管化，能夠將成骨細胞前體細胞、相關因子、營養(yǎng)物質及其他參與骨修復的細胞攜帶到局部微環(huán)境中，并帶走局部新陳代謝產物，以及壞死和分解產物，從整體上維持有利于這一生理過程的代謝微環(huán)境［6，7］。本實驗透明標本觀察可以看出A組、B組在術后第4周時可見小血管以芽生的方式從血管束中長出，以后逐漸增多并開始向外周長入，術后第12周時與從材料邊緣長入的血管形成吻合，相反C組材料中央的血管形成至12周時仍不明顯。說明血管束植入的辦法可以促進血管化，而且相對于血管網(wǎng)包裹而言可能具有更大的優(yōu)點，血管束植入材料內部以后縮短了再血管化的距離，比較符合骨的生理血供特點。這與國內外學者的研究結果是一致的。Philippe等［8］將中空的復合骨髓基質細胞的珊瑚陶瓷材料置于大鼠大腿肌袋中，分離股動、靜脈將其植入材料的管道內，發(fā)現(xiàn)血管束的植入明顯促進了材料細胞復合物的血管化及成骨能力。楊志明等［5］將中空多孔管狀羥基磷灰石材料消毒后通過中空管道植入兔動靜脈血管束，保持近端的供血，研究表明，用血管束植入中空材料內，可有較快的血管化過程。

表3 移植物新生骨面積比與血管面積比分析結果（%）Tab.3Analysis of the ratio of osteogenic and neovascularization areas in implant（%）

另外，本實驗中植入的血管束選用了隱動、靜脈，隱動脈是股動脈發(fā)出的分支，走行長，位置也相對恒定，常與其隱靜脈相伴行，而且植入材料內部以后由于沒有阻斷血供，不會造成動物術后下肢的壞疽，不影響其活動、進食。股三角區(qū)神經、血管的解剖部位也相對恒定，變異小，制作模型操作簡單，并且模型的統(tǒng)一性和可重復性好，用來研究各種骨缺損的效果更為方便和科學，也能作為組織工程骨血管化、神經化重建研究的一種骨缺損動物模型。

bFGF是骨和軟骨組織中的一種成分，它可以促進成骨細胞和軟骨細胞的分裂增殖，在培養(yǎng)中抑制軟骨細胞的最終分化；具有強大的促進成纖維細胞增殖能力，也是最早確認的促內皮細胞生長因子之一，有強大的內皮細胞趨化作用，具有很強的促血管新生能力；還在傷口愈合和組織修復中發(fā)揮著重要作用。本實驗中bFGF可能起著促進成骨和促血管化的雙重作用。雖然bFGF對許多細胞有作用，但備受關注的是其促進血管內皮細胞有絲分裂從而介導組織中新生血管形成的作用。

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