組織因子途徑抑制物對兔急性心肌梗死再灌注后無復(fù)流的影響

齊曉云，徐萍，李春華，楊洋，王萬糧，張繼紅，劉潔，劉冬梅

（沈陽醫(yī)學院 沈洲醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽 110002）

急診經(jīng)皮冠脈介入術(shù)及溶栓治療已成為急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）主要的再灌注治療方法。但Ito使用心肌聲學造影發(fā)現(xiàn)，AMI冠脈再通后心肌組織再灌注并不完全，甚至出現(xiàn)無再灌注，稱為無復(fù)流現(xiàn)象，其發(fā)生率高達37%［1］。無復(fù)流常常與廣泛而嚴重的心肌損害、進行性的左室擴張以及充血性心力衰竭等嚴重并發(fā)癥相關(guān)。因此，心肌組織微血管灌注已成為當代AMI再灌注治療的重要目標和評估其成功與否的主要指標［2］。目前關(guān)于無復(fù)流發(fā)生的確切機制并不完全清楚，認為其發(fā)生與冠狀動脈微循環(huán)栓塞、微血管痙攣、炎癥及自由基反應(yīng)等有關(guān)。組織因子（tissue factor，TF）是外源性凝血系統(tǒng)的啟動因子，是機體內(nèi)活性最強的促凝物質(zhì)之一。組織途徑因子抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是 TF 的生理性拮抗劑，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的外源性凝血途徑的抑制物。本研究通過建立兔心肌梗死再灌注模型，觀察TFPI對再灌注后無復(fù)流的影響，并探討無復(fù)流的發(fā)生機制以及TFPI防治無復(fù)流的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康日本大耳白兔30只（中國醫(yī)科大學實驗動物中心），體質(zhì)量2.5～3.0 kg，隨機分為假手術(shù)組（n=6）、生理鹽水對照組（n=12）和 TFPI組（n=12）。AMI造模成功后，觀察1 h存活者，生理鹽水對照組為5只，TFPI治療組6只。TFPI組于再灌注前30 min將TFPI（美國RD公司）1 μg/kg溶于10 ml生理鹽水，緩慢耳緣靜脈注射，假手術(shù)組和鹽水對照組給予相同劑量的生理鹽水溶液。

1.2 AMI再灌注無復(fù)流模型的制備

0.4%戊巴比妥鈉（20 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉動物，開胸暴露心臟，剪開心包，于肺動脈圓錐和左心耳交界處、主動脈起始部下方約2～3 mm處結(jié)扎冠狀動脈。結(jié)扎成功后可見心臟前壁運動幅度減弱。心電圖示ST段進行性弓背樣抬高，結(jié)扎60 min后剪斷結(jié)扎線使冠狀動脈再通，再灌注90 min后取血，注入染色劑硫黃素S，處死動物，行組織病理學檢測。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.3 無復(fù)流及壞死面積的測定

參照文獻［3］的方法注射染色劑和病理切片。切片拍照后，采用Image-Pro Plus彩色圖像處理系統(tǒng)（美國Media Cybermetics公司）計算出左心室室壁心肌面積（left ventricular wall area，LVWA）、結(jié)扎區(qū)心肌面積（ligation area，LA）及無復(fù)流區(qū)面積（noreflow area，NRA），LA/LVWA表示結(jié)扎區(qū)心肌范圍，NRA/LA表示無復(fù)流心肌范圍。最后將整個心肌切片放入1%、pH7.4的四氮唑紅溶液（美國Sigma公司）中，37℃孵箱中孵化15 min，梗死心肌不著色，非梗死部位心肌呈磚紅色，立即對切片進行拍照，計算出梗死心肌面積（necrosis area，NA），以NA/LA表示壞死心肌范圍。

1.4 免疫組化檢測

將蠟塊5 μm厚連續(xù)切片，按SABC免疫組化試劑盒步驟操作。主要觀察TF、白介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子 α（tumornecrosis factor-α，TNF-α） 的蛋白表達。一抗分別為 TF、IL-6和TNF-α單克隆抗體（1∶100稀釋，武漢博士德公司），DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陽性對照用PBS代替一抗。利用MetaMorph offline圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機選擇5個高倍視野（×40），測量心肌梗死及周圍區(qū)TF、IL-6和TNF-α免疫組化的平均集成吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 TFPI對兔AMI再灌注后心肌無復(fù)流范圍和壞死范圍的影響

AMI再灌注后，鹽水對照組無復(fù)流范圍為（52.1±6.9）%，心肌壞死范圍為（91.2±5.7）%，提示 AMI再灌注后無復(fù)流范圍大，且結(jié)扎區(qū)心肌幾乎全部壞死。TFPI組無復(fù)流范圍為（34.1±7.1）%、心肌壞死范圍為（79.1±7.6）%，與對照組相比均顯著降低（P<0.05，P<0.01），結(jié)扎區(qū)心肌范圍兩組比較無顯著差異（分別為44.2%和41.2%，P>0.05），提示TFPI能顯著縮小AMI再灌注后無復(fù)流范圍和壞死范圍。

2.2 TFPI對兔AMI再灌注后心肌梗死及周圍區(qū)TF、TNF-α和IL-6免疫組化的平均集成吸光度值的影響

AMI再灌注后，鹽水對照組、TFPI組IL-6和TF的水平與假手術(shù)組比較顯著升高（P均<0.05），TNF-α也增高，但無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；TFPI組與鹽水對照組比較IL-6和TF水平顯著下降（P<0.01），TNF-α也下降，但無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見表1，圖1～3。

表1 TFPI對兔AMI再灌注后心肌梗死及周圍區(qū)TF、TNF-α和IL-6免疫組化的平均集成吸光度值水平的影響（±s）Tab.1 Effect of TFPI on the average integrated absorbance values of TF，TNF-α and IL-6 after actue myocardial infarction and reperfusion in rabbits（±s）

表1 TFPI對兔AMI再灌注后心肌梗死及周圍區(qū)TF、TNF-α和IL-6免疫組化的平均集成吸光度值水平的影響（±s）Tab.1 Effect of TFPI on the average integrated absorbance values of TF，TNF-α and IL-6 after actue myocardial infarction and reperfusion in rabbits（±s）

TNF-α，tumor necrosis factor-α；IL-6，interleukin-6；TF，tissue factor.1）P<0.05 vs shamgroup；2）P<0.05 vs saline group.

Group n TNF-α IL-6 TF Sham 6 89.12±49.76 54.69±17.39 85.18±24.17 Saline 5 114.82±31.44 110.07±21.771） 129.91±35.491）TFPI 6 79.49±43.82 80.07±13.651），2） 43.77±6.651），2）

3 討論

無復(fù)流是目前臨床經(jīng)皮冠脈介入術(shù)、搭橋術(shù)、溶栓術(shù)等心臟再灌注治療常見的嚴重并發(fā)癥，也成為防治缺血性心臟病和心臟介入性治療的重要課題。迄今為止無復(fù)流的確切機制仍不明確，可能為炎癥和凝血機制等多因素參與的復(fù)雜過程［4］。我們通過建立兔AMI后再灌注模型，探討無復(fù)流的機制，觀察TFPI對AMI再灌注后無復(fù)流的防治作用。

本研究應(yīng)用TFPI靜脈注射，觀察其對兔AMI再灌注后心肌無復(fù)流的影響。結(jié)果顯示，兔缺血再灌注后IL-6、TNF-α和TF的表達均增加，IL-6和TF的表達增加更顯著；鹽水對照組IL-6和TF的水平顯著高于假手術(shù)組（P<0.05）；TFPI組IL-6和TF的水平顯著低于鹽水對照組（P<0.05），TFPI顯著抑制了AMI再灌注后IL-6和TF的表達，說明TFPI可明顯抑制兔AMI再灌注后的炎癥和凝血反應(yīng)。同時，鹽水對照組兔心肌的無復(fù)流范圍達到了缺血面積的52.1%，在缺血面積兩組間無統(tǒng)計學差異的情況下（44.2%和41.2%），TFPI組兔心肌的無復(fù)流范圍（34.1%）明顯小于對照組（P<0.01），說明 TFPI可明顯縮小兔心肌后無復(fù)流范圍。

TFPI可以減輕AMI再灌注后無復(fù)流，其機制可能與以下因素相關(guān)。首先，TFPI作為一種外源性凝血途徑的抑制物，通過調(diào)節(jié)TF誘導的凝血過程強烈的抑制血栓形成。TF又稱凝血因子Ⅲ，是外源性凝血系統(tǒng)的啟動因子，是機體內(nèi)活性最強的促凝物質(zhì)之一。在生理狀況下，內(nèi)皮細胞作為屏障將血液與TF分開，當組織損傷破壞此屏障時，TF得以與血液中的因子Ⅶa結(jié)合，進而激活因子Ⅹ產(chǎn)生因子Ⅹa，并形成TF/因子Ⅶa/因子Ⅹa復(fù)合物，與蛋白激酶受體相互作用，可刺激機體生成凝血酶，導致血小板的激活和聚集，并釋放一系列活性物質(zhì)，促使血液凝固、血栓形成。TFPI是TF的生理性拮抗劑，其通過兩個反應(yīng)抑制TF依賴的凝血途徑：一是與因子Ⅹa緊密結(jié)合使之失活；二是因子Ⅹa/TFPI復(fù)合物與因子Ⅶa/TF結(jié)合為因子Ⅹa/TFPI1/因子Ⅶa/TF聚體，滅活后者［5］。有學者通過對小鼠的研究［6］，發(fā)現(xiàn)TFPI不但能有效地防止動脈粥樣硬化的發(fā)生，而且可以減少血栓的形成。Golino等［7］研究表明TFPI基因cDNA轉(zhuǎn)染動脈內(nèi)皮細胞后，可有效阻止血管內(nèi)血栓形成。

其次，TFPI可通過抑制TF介導的炎性反應(yīng)，減少無復(fù)流。TF/因子Ⅶa/因子Ⅹa可以激活參與炎性反應(yīng)的內(nèi)皮細胞及其他類型的細胞，使其產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，這些炎性介質(zhì)一方面可以損傷組織、破壞TF與血液間的屏障，使TF激活并結(jié)合其他凝血因子，另一方面可誘導TF的產(chǎn)生，使外源性凝血途徑進一步激活，生成更多凝血酶，導致機體產(chǎn)生更多血栓，炎性反應(yīng)進一步加重［8］。有研究表明，局部TFPI導入球囊損傷的血管，通過抗炎性反應(yīng)降低C反應(yīng)蛋白，其對抗炎性反應(yīng)的機制是通過抑制TF作用來實現(xiàn)的［9］。

第三，TFPI可抑制TF誘導的炎癥和凝血的惡性循環(huán)。因子Ⅶa、因子Ⅹa通過作用于蛋白激酶受體，誘導機體產(chǎn)生腫瘤壞死因子、白介素、黏附分子等物質(zhì)加重炎性反應(yīng)，進一步誘導TF的產(chǎn)生，使凝血系統(tǒng)進一步激活，產(chǎn)生更多血栓，炎性反應(yīng)進一步加重，這樣炎癥和凝血系統(tǒng)形成惡性循環(huán)［10］。已有眾多的研究表明，IL-6和TNF-α是炎癥介導的心肌缺血再灌注損傷中的重要致炎因子，心肌缺血再灌注時IL-6和TNF-α均顯著升高，從而促進炎性反應(yīng)，促凝、促血栓形成。

綜上，TFPI可通過抑制TF誘導的血栓形成和炎性反應(yīng)而抑制AMI后無復(fù)流的發(fā)生發(fā)展。TFPI作為一種多重作用的因子，可為臨床無復(fù)流的防治提供新的靶點。

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