FMRP影響小鼠小腦皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育與遷移的實(shí)驗(yàn)研究

孫曉紅，董玉霞，馮昱，宋衛(wèi)科，何悅，何志義

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110032；2.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110001）

脆性X智力障礙蛋白（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP）是脆性X智力障礙1（fragile X mental retardation 1，F(xiàn)mr1）基因的編碼產(chǎn)物，F(xiàn)mr1 基因（CGG）區(qū)擴(kuò)增突變導(dǎo)致該基因沉默致使FMRP不表達(dá)或低表達(dá)［1，2］，是導(dǎo)致脆性 X 綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）的主要原因。目前研究發(fā)現(xiàn)，20%～30%FXS患者伴癲癇發(fā)作［3］，因此，小腦中調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性的谷氨酸（glutamatergic acid，Glu）和γ氨基丁酸（gamma aminobutyric acidergic acid，GABA）神經(jīng)核團(tuán)的形態(tài)與功能的變化，成為FXS發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對胚胎發(fā)育期小鼠小腦神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的研究探討FMRP缺失對小腦神經(jīng)元發(fā)育遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及FXS陽性小鼠類型鑒定

將I304N錯譯突變基因插入全長的哺乳動物Fmr1cDNA，構(gòu)建FMRPmutant-pEGFP與pEGF質(zhì)粒；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入胚胎小鼠側(cè)腦室，轉(zhuǎn)染濃度為pEGFP 1.3 μg/μl，F(xiàn)MRPmutant-pEGFP 1.3 μg/μl；并對鼠尾組織進(jìn)行PCR鑒定小鼠基因型，具體操作步驟見前期實(shí)驗(yàn)［4］。pEGFP組為對照組，F(xiàn)MRPmutantpEGFP為實(shí)驗(yàn)組。

1.2 腦組織取材與染色

胚胎17 d對小鼠小腦組織進(jìn)行取材，4%多聚甲醛固定過夜，脫水透化處理后制成蠟塊，切片機(jī)切成20 μm的冠狀切片。分別進(jìn)行Nissl染色及免疫熒光染色，免疫熒光染色所用一抗為兔抗GFP（1∶500），兔抗 Tbr2（1∶2 000）；二抗為 Alexa Fluor-488山羊抗兔（1∶1 000）。

1.3 圖像獲取及數(shù)據(jù)分析

用連有Olympus BX51熒光共聚焦顯微鏡的MicroFire S099808的數(shù)碼相機(jī)獲取高分辨率的圖片，Image-Pro Plus version6進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 Nissl染色觀察小腦深部核團(tuán)與浦肯耶細(xì)胞（Purkinje cell，PC）

大體標(biāo)本觀察到實(shí)驗(yàn)組胚胎小鼠小腦較對照組略小，冠狀切片尼氏染色顯示，對照組小鼠小腦細(xì)胞較大而圓，排列整齊，位于外顆粒層與內(nèi)顆粒層間形成PC細(xì)胞層（圖1A），而實(shí)驗(yàn)組PC較小，呈現(xiàn)非極性紊亂排列，核仁固縮濃染等特征，部分細(xì)胞滯留于內(nèi)層顆粒細(xì)胞層而無法正常移行入PC細(xì)胞層（圖1B）。小腦深部核團(tuán)（deep cerebellar neuclei，DNC）包括3種核：頂核、中間核和齒狀核，Nissl染色顯示對照組小鼠小腦中間核和齒狀核核排列緊密，無明顯界限（圖1C），而實(shí)驗(yàn)組中間核和齒狀核核體積縮小，核團(tuán)間彼此分離，被白質(zhì)（white matter，WM）分隔（圖1D）。

2.2 免疫熒光染色觀察小腦單極刷狀緣細(xì)胞表達(dá)及分布

T 盒轉(zhuǎn)錄因子（T-box transcription factor，Tbr2）是單極刷狀緣細(xì)胞（unipolar brush cell，UBC）標(biāo)志物。免疫熒光染色顯示Tbr2標(biāo)記的UBC陽性細(xì)胞主要分布在小腦側(cè)腦室區(qū)（ventricular zone，vz），對照組Tbr2陽性細(xì)胞分別從菱唇（rhombic lip，rl）與外顆粒層途經(jīng)白質(zhì)形成兩條遷移路徑（圖1E），而實(shí)驗(yàn)組Tbr2陽性細(xì)胞僅存在由從菱唇經(jīng)白質(zhì)一條遷移路徑，并在小腦側(cè)腦室區(qū)異常聚集（圖1F）。

3 討論

小腦主要包含兩大類功能性核團(tuán)：谷氨酸鹽神經(jīng)元和γ氨基丁酸鹽神經(jīng)元，小腦皮質(zhì)發(fā)育過程中這兩類神經(jīng)元發(fā)育遷移等形態(tài)學(xué)變化影響著小腦興奮性功能通路與抑制性功能通路的平衡［5］。谷氨酸鹽神經(jīng)元包括 DNC、UBC 及顆粒細(xì)胞（Granule），γ氨基丁酸鹽神經(jīng)元包括PC和抑制性中間神經(jīng)元。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對照組小鼠小腦中間核和齒狀核核排列緊密，無明顯界限，而實(shí)驗(yàn)組中間核和齒狀核核體積縮小，核團(tuán)間彼此分離，被白質(zhì)分隔，提示FMRP缺乏時(shí)小腦新皮質(zhì)神經(jīng)元前體細(xì)胞生成及移行異常，可能是導(dǎo)致FXS患者認(rèn)知障礙及行為異常的原因之一；Tbr2是發(fā)育小鼠小腦內(nèi)UBC標(biāo)志物［6］，Tbr2陽性細(xì)胞在側(cè)腦室區(qū)異常聚集與遷移路徑的改變提示小腦內(nèi)谷氨酸鹽神經(jīng)元的生成和遷移出現(xiàn)異常［7］。此外，實(shí)驗(yàn)組PC呈現(xiàn)非極性紊亂排列，核仁固縮濃染等特征，部分細(xì)胞滯留于內(nèi)層顆粒細(xì)胞層而無法正常移行入PC細(xì)胞層，提示FMRP缺失可能對PC產(chǎn)生影響導(dǎo)致FXS患者癲癇癥狀的發(fā)生［8］。

綜上，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FMRP缺失時(shí)小腦興奮性及抑制性兩類神經(jīng)元的發(fā)育遷移均出現(xiàn)異常，這有助于進(jìn)一步探討FXS患者和Fmr1基因敲除小鼠認(rèn)知障礙和癲癇的發(fā)生機(jī)制，為早期預(yù)防與治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］JinP，WarrenST.NewinsightsintofragileXsyndrome：From molecules to neurobehaviors［J］.Trends Biochem Sci，2003，28（3）：152-158.

［2］Ramos A，Hollingworth D，Pastore A.The role of a clinically important mutation in the fold and RNA-binding properties of KH motifs［J］.RNA，2003，9（3）：293-298.

［3］Garber K，Smith KT，Reines D，et al.Transcription，translation and fragile X syndrome［J］.Curr Opin Genet Dev，2006，16（3）：270-275.

［4］孫曉紅，董玉霞，馮昱，等.FMRP促進(jìn)胚胎小鼠大腦皮層神經(jīng)元發(fā)育與遷移［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2010，16（3）：200-203.

［5］Bear MF，Huber KM，Warren ST.The mGluR theory of fragile X mental retardation［J］.Trends Neurosci，2004，27（7）：370-377.

［6］Englund C，F(xiàn)ink A，Lau C，et al.Pax6，Tbr2，and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia，intermediate progenitor cells，and postmitotic neurons in developing neocortex［J］.J Neurosci，2005，25（1）：247-251.

［7］Mathis L，Nicolas JF.Progressive restriction of cell fates in relation to neuroepithelial cell mingling in the mouse cerebellum［J］.Dev Biol，2003，258（1）：20-31.

［8］Hoshino M，Nakamura S，Mori K，et al.Ptf1a，a bHLH transcriptional gene，defines GABAergic neuronal fates in cerebellum［J］.Neuron，2005，47（2）：201-213.