人結(jié)腸癌細(xì)胞株CW-2干細(xì)胞生物學(xué)特性研究

劉美，艾亮，陳宓，龍浩，李少林

（重慶醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室，重慶 400016）

癌干細(xì)胞理論認(rèn)為，結(jié)腸癌發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥的根源是腫瘤內(nèi)部一小部分具有自我更新、多向分化潛能的細(xì)胞，即癌干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）［1，2］分離并對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究對(duì)結(jié)腸癌的診斷、治療具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑+流式細(xì)胞分選技術(shù)（多重聯(lián)合法）逐步分離純化人結(jié)腸癌細(xì)胞株CW-2干細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究［3～6］。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株CW-2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI 1640和DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胰酶購自Gibco公司；重組人表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、重組人白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、重組人堿性成纖維生長因子（fibroblast growth factor-basic，bFGF）購自 Sinobio 公司；青霉素 G、鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；奧沙利鉑購自深圳海王藥業(yè)有限公司；Anti-CD44-FITC、Anti-Ep－CAM-PerCP-Cy5.5和其同型抗體購自BD Bioscience公司；Transwell小室購自Costar公司；24孔板購自Corning公司；Matrigel膠購自BD Bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 CW-2細(xì)胞在傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基（serum-supplemented medium，SSM）中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑富集結(jié)腸癌CW-2干細(xì)胞：

將SSM中處于對(duì)數(shù)增長期的細(xì)胞以105/ml接種于由 DF12（DMEM/F12）、EGF（20 ng/m1）、bFGF（10 ng/m1）、LIF（10 ng/m1）組成的無血清培養(yǎng)基（serum-free medium，SFM）中傳代培養(yǎng)。另培養(yǎng)基中添加青霉素 G（l00 U/ml）、鏈霉素（100 U/ml）和奧沙利鉑（1 μg/m1）。藥物處理24 h后800 r/min離心5 min去除化療藥物奧沙利鉑，重新加入無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。前2周直接向培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液。2周后通過胰酶消化法和機(jī)械吹打法分離成單細(xì)胞懸液后傳代。每日觀察CW-2細(xì)胞在SFM中形成腫瘤干細(xì)胞球的過程。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分選：

將SFM+奧沙利鉑處理14 d后細(xì)胞球消化、離心、PBS清洗、熒光抗體標(biāo)記后在FACS上分選出CD44+EpCAM+和 CD44－EpCAM－細(xì)胞。

1.2.4 流式細(xì)胞檢測CD44、EpCAM的表達(dá)：

流式細(xì)胞儀分選后CD44+EpCAM+細(xì)胞上流式細(xì)胞儀分析檢測CD44+EpCAM+細(xì)胞比例。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測：

收集 FACS 分選后 CD44+EpCAM+和 CD44－Ep－CAM－細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

1.2.6 動(dòng)物致瘤實(shí)驗(yàn)：

4～5周齡NOD/SCID三聯(lián)免疫缺陷小鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，性別不限。隨機(jī)分成SSM 組、CD44+EpCAM+細(xì)胞組、CD44－EpCAM－細(xì)胞組，將SSM培養(yǎng)細(xì)胞、多重聯(lián)合分選后CD44+Ep－CAM+細(xì)胞、CD44－EpCAM－細(xì)胞收集后調(diào)為所需濃度，按1∶1比例與Matrigel混合，均以104個(gè)細(xì)胞數(shù)量接種NOD-SCID小鼠右肩部皮下。每周2次觀察腫瘤生長狀況，測量并記錄第 4，7，14，21，28 d 腫瘤的體積。

1.2.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：

將 10 mg/ml的 Matrigel膠與 RPMI 1640培養(yǎng)液按1∶5的比例混合，每孔取60 μl混合液均勻鋪與Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜上制成人工基底膜。37℃溫育30 min使膠固化。下室內(nèi)加入600 μl趨化因子（3T 3上清液）：胎牛血清培養(yǎng)液比例為1∶1的混合培養(yǎng)液，上室內(nèi)分別加入500 μl血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞+SSM、CD44+EpCAM+細(xì)胞+SFM，CD44－EpCAM－細(xì)胞+SSM，各組細(xì)胞密度均為 3×105/ml，每組設(shè)6個(gè)相同的孔。在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后×200倒置顯微鏡下觀察下室內(nèi)細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)×200鏡視野下細(xì)胞的數(shù)量，每下室記3個(gè)視野后取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多重測量設(shè)計(jì)資料的方差分析、完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞學(xué)檢測

多重聯(lián)合分選后雙陽性細(xì)胞中CD44+EpCAM+癌干細(xì)胞含量為89.57%。

2.2 細(xì)胞周期檢測

CD44+EpCAM+細(xì)胞處于低增殖狀態(tài)，G0/G1期細(xì)胞占86.19%，G2+S期細(xì)胞占13.81%，而CD44－Ep－CAM－細(xì)胞相對(duì)處于高增殖狀態(tài)，G0/G1期細(xì)胞占56.04%，G2+S細(xì)胞占43.96%（圖 1）。

2.3 體外侵襲實(shí)驗(yàn)

多重聯(lián)合分選后CD44+EpCAM+細(xì)胞組、SSM組和CD44－EpCAM－細(xì)胞組下室細(xì)胞均數(shù)分別為188個(gè)/視野、56個(gè)/視野、0個(gè)/視野。各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果提示，多重聯(lián)合分選后CD44+EpCAM+癌干細(xì)胞的侵襲能力大于單純SSM培養(yǎng)細(xì)胞和 CD44－EpCAM－細(xì)胞（圖 2）。

2.4 體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

CD44＋EpCAM＋細(xì)胞組 4 d 可觸及腫瘤，SSM 組14 d才可觸及腫瘤，而CD44－EpCAM－細(xì)胞組始終無腫瘤生長。測量并記錄 4 d、7 d、14 d、21 d、28 d 腫瘤的體積。各組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？梢姸嘀芈?lián)合分選后的CD44+EpCAM+細(xì)胞的成瘤能力明顯強(qiáng)于SSM培養(yǎng)細(xì)胞和CD44－EpCAM－細(xì)胞（圖 3）。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞分選方法的選擇是獲得癌干細(xì)胞的關(guān)鍵。提高癌干細(xì)胞的純度是目前國內(nèi)外學(xué)者們研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以結(jié)腸癌細(xì)胞株CW-2為研究對(duì)象，將無血清懸浮培養(yǎng)法、化療藥物法、流式細(xì)胞分選法聯(lián)合起來逐步分離出了純度高達(dá)89.57%的CD44+EpCAM+癌干細(xì)胞，獲得了較以往［3，7］純度更高的癌干細(xì)胞。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)在獲得純度相對(duì)較高癌干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，還通過細(xì)胞周期檢測、體外侵襲實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)［8］對(duì) CD44＋EpCAM＋癌干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究。研究發(fā)現(xiàn)CD44＋EpCAM＋癌干細(xì)胞具有比普通細(xì)胞和非癌干細(xì)胞更強(qiáng)的成瘤能力、侵襲能力和增殖能力。

研究結(jié)果表明，CD44＋EpCAM＋癌干細(xì)胞是一群具有高致瘤性、高侵襲性、低增殖性細(xì)胞。通過本實(shí)驗(yàn)我們不但提高了所得癌干細(xì)胞的純度，還進(jìn)一步深化了癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究。為癌干細(xì)胞理論研究和臨床實(shí)踐奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為腫瘤的治療開辟了新的道路。

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