曲古抑菌素A對人卵巢癌細胞系A2780細胞周期的影響

馬曉欣，趙冬妮，金英楠，苗青

（1.中國醫(yī)科大學 附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.北京市西城區(qū)疾病預防控制中心 生殖保健科，北京 100029）

表達遺傳學在不改變基因序列的情況下，通過DNA甲基化、組蛋白共價修飾使基因表達發(fā)生可遺傳改變，是腫瘤發(fā)生的主要原因之一。曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）源自鏈霉菌代謝產(chǎn)物，具有組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACI）的特征，能通過 Zn2+螯合作用特異、可逆的抑制哺乳動物組蛋白去乙酰輔酶活性，誘導腫瘤細胞周期阻滯、分化及凋亡。細胞周期素依賴激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI）p21WAF/CIPI與細胞周期密切相關，目前研究表明，p21WAF/CIPImRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白表達的變化是卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的因素之一［1］。本實驗以人卵巢癌細胞系A2780為靶細胞，通過檢測細胞周期和p21WAF/CIPImRNA的表達，探討TSA對人卵巢癌A2780細胞的影響及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞系A2780由中國醫(yī)科大學細胞生物教研室惠贈。TSA購自美國Sigma公司，胎牛血清購自天津灝洋生物制品科技有限公司，RNase酶、碘化丙錠購自美國Sigma公司，Trizol Reagent購自美國GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將A2780細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中貼壁傳代培養(yǎng)。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期變化：取對數(shù)生長期A2780細胞，分為A、B兩組。A組細胞在100 nmol/L 的 TSA 下分別培養(yǎng) 6，12，24，36，48 h；B 組細胞分別在 0，50，100，200，400 nmol/L 的 TSA 下培養(yǎng)24 h。收集細胞，以75%乙醇固定，加入10 μl RNaseA（10 μg/ml），置于 37℃水浴 30 min 后以 200 μl碘化丙錠（100 μg/ml）染色，4℃避光染色 30 min，300目篩網(wǎng)過濾后上流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR檢測p21WAF/CIPImRNA的表達：收集并分離經(jīng)上述方法培養(yǎng)后的細胞1×107個，加Trizol裂解液，提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒手冊操作，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：65℃1 min，30℃5 min，15～30℃內(nèi)勻速升溫，65℃ 30 min，98℃ 5 min，5 ℃ 5 min；PCR 擴增：β-actin 引物序列：Upward primer：5′GGCATCGTGATGGACTCC 3′；Downward primer：5′GCTGGAAGGTGGACAGCG 3′；產(chǎn)物長度620 bp。 p21WAF/CIPI引 物 序 列 ：Upward primer：5′GAGCCCAGACGTTATTCT 3′；Downward primer：5′AGTCCCACAACTGCCTAT 3′；產(chǎn)物長度 136 bp。PCR反應條件：94℃變性3 min后，以94℃45 s，51.5℃1 min，72℃1 min的順序循環(huán)35次，最后72℃延伸7 min。以β肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)對照檢測轉(zhuǎn)錄效率。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像。p21WAF/CIPI的表達以所測產(chǎn)物的條帶強度與內(nèi)參對照β-actin條帶強度的比值來表示。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 TSA作用不同時間對A2780細胞周期分布的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，A組細胞隨著藥物作用時間延長，G2/M期細胞增加，S期細胞減少，于36 h達到頂峰，各時間組間比較見表1。

表1 100 nmol/L TSA在不同時間作用于A2780的細胞周期變化及p21WAF/CIPImRNA的表達（±s）Tab.1 Effect of 100 nmol/L TSA on the cell cycle andp21WAF/CIPImRNA expression in A2780 cells（±s）

表1 100 nmol/L TSA在不同時間作用于A2780的細胞周期變化及p21WAF/CIPImRNA的表達（±s）Tab.1 Effect of 100 nmol/L TSA on the cell cycle andp21WAF/CIPImRNA expression in A2780 cells（±s）

1）P<0.05 vs 12 h group；2）P<0.05 vs 6 h group；3）P<0.05 vs 24 h group；4）P<0.05 vs 36 h group

Time of TSA treatment（h） G0/G1 G2/M S Expression ofp21WAF/CIPImRNA 6 70.017±3.140 10.253±2.847 19.063±2.215 2.556±0.333 12 72.677±2.426 12.013±1.743 15.310±1.8342） 3.322±0.1562）24 69.623±1.708 20.043±1.8951），2） 10.167±0.2581），2） 4.755±0.3891），2）36 66.727±1.496 27.913±1.7881），2），3） 5.360±1.8091），2），3） 4.313±0.7061），2）48 65.963±1.9571） 28.380±0.8581），2），3） 5.657±1.7351），2），3） 2.801±0.1493），4）

2.2 TSA作用不同時間對A2780細胞p21WAF/CIPI mRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，A組細胞于12 h開始出現(xiàn)p21WAF/CIPImRNA表達水平的升高，并隨作用時間延長而變化，于24 h達到頂峰，48 h開始表達出現(xiàn)下降，各時間組間比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 不同濃度的TSA對A2780細胞周期分布的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，B組細胞于100 nmol/L開始，隨著藥物濃度的增加G2/M期細胞增加，S期細胞減少，各濃度組間比較見表2。

2.4 不同濃度TSA對A2780細胞p21WAF/CIPImRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，B組細胞于100 nmol/L開始，p21WAF/CIPImRNA的表達水平增高，并隨著藥物濃度的增加而升高，各濃度組間比較見表2。

3 討論

目前認為，表遺傳修飾紊亂是腫瘤發(fā)生的主要原因之一。乙酰化是組蛋白共價修飾主要形式，受組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HAT）和去乙酰化酶（histone deacetylases，HDAC）調(diào)節(jié)，HAT可使組蛋白乙酰化，激活轉(zhuǎn)錄，HDAC則抑制轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙酰化和去乙?；诨虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，蛋白乙酰化水平由組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙?；傅膭討B(tài)平衡調(diào)節(jié)［2］。

組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylaseinhibitors，HDACI）主要包括 TSA、丁酸（butyric acid，BA）、丙戊酸（valproic acid，VPA）等。HDACI通過提高組蛋白乙?；蕉鴱娜旧|(zhì)水平調(diào)節(jié)特定基因的表達，誘導腫瘤細胞周期阻滯和分化，誘導細胞發(fā)生凋亡［3］。以HDACI處理體外培養(yǎng)腫瘤細胞可引起G1或G2/M期阻滯。且HDACI具有選擇性腫瘤毒性，造血系統(tǒng)不受影響或僅受輕微影響，在動物實驗中顯示其發(fā)揮作用的劑量僅產(chǎn)生較弱的毒副作用，目前已有多種HDACI進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，展現(xiàn)出良好的應用前景［4］。

表2 不同濃度TSA對A2780細胞作用24 h細胞周期變化及p21WAF/CIPImRNA的表達（±s）Tab.2 Effect of different concentrations of TSA treatment for 24 h on the cell cycle andp21WAF/CIPImRNA expression in A2780 cells（±s）

表2 不同濃度TSA對A2780細胞作用24 h細胞周期變化及p21WAF/CIPImRNA的表達（±s）Tab.2 Effect of different concentrations of TSA treatment for 24 h on the cell cycle andp21WAF/CIPImRNA expression in A2780 cells（±s）

1）P<0.05 vs 0 nmol/L group；2）P<0.05 vs 50 nmol/L group；3）P<0.05 vs100 nmol/L group；4）P<0.05 vs 200 nmol/L group；

Group（TSA concentration，nmol/L） G0/G1 G2/M S Expression ofp21WAF/CIPImRNA 0 59.250±4.015 4.573±0.354 36.177±3.691 1.523±0.447 50 64.900±3.650 5.283±1.028 29.817±2.8401） 2.122±0.356 100 69.197±4.6801） 11.043±1.6031），2） 19.760±3.1391），2） 3.451±0.2601），2）200 67.250±2.8101） 23.003±1.5541），2），3） 9.747±1.2861），2），3） 5.428±0.7251），2），3）400 64.320±2.447 32.177±2.5801），2），3），4） 3.503±0.5061），2），3），4） 5.494±0.4841），2），3）

曲古抑菌素A是HDACI中比較有代表性的一種。研究發(fā)現(xiàn)，TSA能有效激活基因表達、抑制細胞增殖、引起細胞分化或調(diào)亡［5］。

本研究檢測TSA對人卵巢癌細胞A2780凋亡情況的影響時發(fā)現(xiàn)，TSA作用后G2/M期細胞增加，S期細胞減少，且該作用隨著藥物濃度和作用時間的改變而逐步變化。該結(jié)果表明，曲古抑菌素可有效作用于細胞周期，使細胞停滯在G2/M期，減少DNA的復制，進而阻礙了細胞分裂。同時，曲古抑菌素以時間和劑量依賴的形式誘導卵巢癌細胞發(fā)生凋亡。

p21WAF/CIPI是最早被發(fā)現(xiàn)的細胞周期素依賴激酶抑制因子（CDKI），CDKI通過與細胞周期素——CDK復合物緊密結(jié)合，或與CDK直接結(jié)合，抑制細胞周期素與CDK結(jié)合而實現(xiàn)負調(diào)控作用。p21WAF/CIPI還可通過抑制CDK2/cyclin B激酶復合物的活性引起G2/M期阻滯。是細胞周期調(diào)控中最具重要意義的負調(diào)控因子［6］。Varshochi［7］和 Davie［8］通過各自實驗認為SP1/SP3是p21轉(zhuǎn)錄啟動子的結(jié)合點，HDAC濃聚可使p21的轉(zhuǎn)錄抑制。HDACI則可抑制SP1/SP3與HDAC結(jié)合或使其從SP1/SP3上分離，提高組蛋白乙?；?，使p21轉(zhuǎn)錄活性增強，p21蛋白重新表達。

已有實驗表明，在卵巢癌中p21WAF/CIPI基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達減少，是卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的因素之一。而TSA可以誘導p21WAF/CIPI在多種腫瘤細胞中表達增強［9，10］，推測組蛋白乙?；揎検?p21WAF/CIPI在腫瘤細胞中表達靜默的基礎。本實驗將不同濃度或不同時間的曲古抑菌素作用于A2780細胞，發(fā)現(xiàn)曲古抑菌素可以時間和劑量依賴的形式增強p21WAF/CIPI的表達，而p21WAF/CIPI表達的變化與腫瘤細胞周期分布的變化趨勢相一致。推測TSA可通過使p21WAF/CIPI基因組蛋白明顯乙?；?，增加轉(zhuǎn)錄活性，增加p21WAF/CIPI的表達，進而引起G2/M期阻滯，抑制細胞過度增殖，對細胞增長停滯起關鍵作用。

組蛋白去乙?；敢种苿┩ㄟ^對其靶基因p21WAF/CIPI的調(diào)節(jié)，干擾細胞周期，阻礙細胞分裂，實現(xiàn)對卵巢癌細胞增殖的抑制作用，有望成為臨床上治療惡性腫瘤的有效手段。

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