dBcAMP通過(guò)上皮生長(zhǎng)因子受體間接激活誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化

李紅梅，楊曉臨，彭亮

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院臨床藥理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001）

星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)分布最廣泛的一類(lèi)細(xì)胞，也是膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大的一種，約占腦細(xì)胞容量的40%。研究表明，膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織損傷或缺血時(shí)發(fā)生激活現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大、數(shù)量增多和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)增加等一系列形態(tài)和功能的變化［1］。了解星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制至關(guān)重要。研究表明，提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）濃度能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化，因此常用作星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)分化的研究模型［1］。本研究應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察了細(xì)胞膜滲透型的cAMP類(lèi)似物雙丁酰環(huán)腺苷酸（dibutyryl cyclic adenosine monophosphate，dBcAMP）誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化，并進(jìn)一步探討其信號(hào)傳導(dǎo)通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：馬血清購(gòu)自GIBCO公司；DMEM培養(yǎng)基、dBcAMP和Anti-GFAP購(gòu)自Sigma公司；GM6001和AG1478購(gòu)自Calbiochem公司；羊抗兔IgG-FITC購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.1.2 動(dòng)物：CD-1小鼠，雌、雄兩性，體質(zhì)量30～40 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及分組：星形膠質(zhì)細(xì)胞取材于新生CD-1小鼠大腦皮質(zhì)。無(wú)菌操作，斷頭剝離腦膜后，取出腦組織。顯微鏡（SZ6045 OLYMPUS，日本）下分離出大腦皮質(zhì)，將其切碎至1 mm3以下組織塊移入離心管中，渦旋器上充分振蕩1 min，分別過(guò)100 μm和70 μm濾膜。將細(xì)胞混懸液種植在含有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。通常1個(gè)小鼠大腦可以鋪10個(gè)35 mm培養(yǎng)皿。使用含有7.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基（8.3 g/L DMEM，2.0 mmol/L L-Glutamine，7.5 mmol/L葡萄糖，1.25 mmol/L丙酮酸鈉，44 mmol/L碳酸氫鈉，0.042 mmol/L酚紅），初始為含20%馬血清的DMEM培養(yǎng)基，每3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基，第3次更換的培養(yǎng)基馬血清濃度降為10%，培養(yǎng)2周。將原代培養(yǎng)2周的細(xì)胞分為6組，并分別孵育72 h：（1）dBcAMP 組：加入 0.25 mmol/L dBcAMP；（2）dB－cAMP+AG1478組：1 μmol/L上皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor recepter，EGFR）特異性拮抗劑AG1478刺激15 min后，再加入0.25 mmol/L dB－cAMP，獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)重復(fù) 2 次；（3）dBcAMP+GM6001組：加入10 μmol/L金屬蛋白酶組織抑制劑GM6001 15 min后，再加入0.25 mmol/L dBcAMP，獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)重復(fù) 2 次；（4）AG1478 組：加入 1 μmol/L AG1478；（5）GM6001 組：加入 10 μmol/L GM6001；（6） 對(duì)照組：未加任何處理因素。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：用冷PBS（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO3·12H2O，2 mmol/L KH2PO3，1 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L MgCl2和7.5 mmol/L glucose，pH 7.4）輕輕沖洗細(xì)胞后，加入純甲醇-20℃固定6 min。再用PBS沖洗細(xì)胞，加入含山羊血清的0.3%Triton X-100 PBS溶液封閉30 min后，加入GFAP特異性抗體（1∶100稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次10 min。然后加入羊抗兔IgG-FITC（1∶100稀釋?zhuān)┓跤?2 h，4℃避光，PBS沖洗3次，每次10 min。50%甘油封片后熒光顯微鏡（BX51 OLYMPUS，日本）觀察。

2 結(jié)果

2.1 dBcAMP誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化

通過(guò)免疫熒光鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞，顯微鏡下放大400倍觀察GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，呈多角形，胞膜光滑，邊界清楚，突觸也較短。經(jīng)0.25 mmol/L dBcAMP處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)樾切?，突觸增長(zhǎng)并相互交織成網(wǎng)狀。

2.2 dBcAMP通過(guò)上皮生長(zhǎng)因子受體間接激活引起星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化

dBcAMP+AG1478組細(xì)胞與對(duì)照組形態(tài)相似，胞體呈多角形，提示AG1478抑制了dBcAMP誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化（圖2）。表明dBcAMP可通過(guò)上皮生長(zhǎng)因子受體的間接激活引起此形態(tài)變化過(guò)程。

2.3 金屬蛋白酶參與dBcAMP引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化

dBcAMP+GM6001組細(xì)胞與對(duì)照組形態(tài)相似，胞體呈多角形（圖3），提示GM6001抑制了dBcAMP誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化。表明金屬蛋白酶參與此形態(tài)變化過(guò)程。

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織損傷或缺血時(shí)可發(fā)生細(xì)胞體積變大、數(shù)量增多和GFAP表達(dá)增加等一系列形態(tài)和功能的變化［2］。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的增多可能是為了滿(mǎn)足星形膠質(zhì)細(xì)胞代謝活動(dòng)的增加。GFAP表達(dá)量的增加反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生和發(fā)育，在神經(jīng)元損傷后的修復(fù)保護(hù)中有重要意義［3］。Friedberg［4］認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化可以作為腦損傷的證據(jù)。因此，了解星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制至關(guān)重要。本研究應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察了dBcAMP誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化，并進(jìn)一步探討其信號(hào)傳導(dǎo)通路。

上皮生長(zhǎng)因子受體廣泛存在于腦內(nèi)［5］，星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)該受體的ErbB1及ErbB4亞型。上皮生長(zhǎng)因子受體間接激活是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)/外信號(hào)傳導(dǎo)途徑，是細(xì)胞根據(jù)外界刺激調(diào)節(jié)自身及其周?chē)窠?jīng)元功能的一種巧妙方式，也是星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)與其相鄰的神經(jīng)元增生、分化、生長(zhǎng)等效應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。經(jīng)典的上皮生長(zhǎng)因子受體間接激活的信號(hào)傳導(dǎo)途徑為［6］：Gi蛋白耦聯(lián)受體激活之后，由三合體Gi蛋白的βγ亞單位激活細(xì)胞內(nèi)金屬蛋白酶，在后者的作用下上皮生長(zhǎng)因子家族成員由細(xì)胞膜表面脫落釋放于細(xì)胞外液，與細(xì)胞自身與鄰近細(xì)胞的EGFR結(jié)合，導(dǎo)致其發(fā)生磷酸化，從而激活細(xì)胞內(nèi)Ras蛋白激酶-絲裂原激活蛋白激酶和磷脂酰肌醇-3激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路。我們?cè)缙诘难芯拷Y(jié)果表明，在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，右旋美托咪啶可通過(guò)上皮生長(zhǎng)因子受體間接激活誘導(dǎo)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化［7，8］。

Haghighat等［9］的研究表明，在大鼠原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，dBcAMP作用24 h后能夠引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)，dB－cAMP能夠引起原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)樾切?，且這種形態(tài)變化能夠被上皮生長(zhǎng)因子受體特異性拮抗劑AG1478所抑制；同時(shí)，這種形態(tài)變化也能夠被金屬蛋白酶組織抑制劑GM6001所阻斷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，dBcAMP通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)金屬蛋白酶，進(jìn)一步導(dǎo)致上皮生長(zhǎng)因子受體自身磷酸化，從而誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。

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