六味地黃丸中馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚對腎上腺素誘導(dǎo)大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響

冷 旺

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德市第一中醫(yī)院，湖南 常德 415000）

六味地黃丸含有丹皮酚、熊果酸、馬錢苷等化學(xué)成分,但目前使用血清藥理學(xué)來研究六味地黃丸的報道僅有幾例，張寧等[1]進行了六味地黃丸血中入血成分的含量測定，確定了其含藥血清中用高效液相色普儀可檢測的馬錢苷、丹皮酚等10種入血成分；提示這些有效成分可能為該方作用的物質(zhì)基礎(chǔ),為進一步研究該方的作用及機理奠定了基礎(chǔ)。在前期實驗中，我們以血藥濃度法作為手段，采用高效液相色譜技術(shù)對六味地黃丸含藥血清進行了測定，發(fā)現(xiàn)馬錢苷、丹皮酚、芍藥苷等均為其主要入血成分，因此，在本研究中我們選用馬錢苷、丹皮酚和芍藥苷三個主要入血成分來研究其對大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響?，F(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD大鼠，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由河南省實驗動物中心提供。許可證號：SCXK（豫）2005-0001。

1.1.2 儀器 3K30型高速冷凍離心機（sigma公司產(chǎn)品）；UV-1600紫外分光光度計 （北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品）；佳能照相系統(tǒng)；XDS-1B體式倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；Heracell型細(xì)胞培養(yǎng)箱 （德國賀利氏產(chǎn)品）；超凈工作臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）；臺式離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；恒溫水浴箱（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）。

1.1.3 藥物與試劑 六味地黃丸（濃縮丸），由湖南省長沙市九芝堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號060361；馬錢苷標(biāo)準(zhǔn)品購自河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然植物教研室；芍藥苷、丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品研究所；腎上腺素，pH 7.2緩沖生理鹽水（自制）；細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM/低糖）購自美國Hyclone公司,胎牛血清購自蘭州民海生物有限公司，胰酶購自sigma公司，cAMP試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素室，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng) 取雄性大鼠腹股溝部純凈脂肪顆粒，pH 7.2緩沖生理鹽水(PBs)洗滌后剪成0.5～1 mm3大小均勻的小顆粒，以1 000 r/min離心10 min取上層的純脂肪顆粒，輕輕地鋪于經(jīng)培養(yǎng)液潤濕的培養(yǎng)瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培養(yǎng)液5～10 mL，塞緊瓶塞，將底面翻轉(zhuǎn)朝上。37℃、5%C02培養(yǎng)1～2 h，待黏附牢固后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶做正常培養(yǎng)每日觀察。原代培養(yǎng)區(qū)域性單層匯合達到約1/2瓶底面積后即可傳代，取培養(yǎng)7代以內(nèi)的大鼠前細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 分組及給藥 取傳代7代以內(nèi)的細(xì)胞分為：空白對照組，馬錢苷高、中、低劑量組，芍藥苷高、中、低劑量組，丹皮酚高、中、低劑量組。其中馬錢苷高、中、低劑量組的給藥濃度分別為 5.0、10.0、20.0 μg/mL，芍藥苷高、中、低劑量組的給藥濃度分別為 3.0、6.0、12.0 μg/mL，丹皮酚高、中、低劑量組的給藥濃度分別為8.0、16.0、32.0μg/mL。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的檢測 取第六代大鼠前脂肪細(xì)胞,以2×105個/mL的濃度傳于50 mL培養(yǎng)瓶中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)至生長旺盛時,棄培養(yǎng)液,給藥后分別培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞,用pH 4.75的醋酸緩沖液懸浮,調(diào)整濃度至106個/mL，取1 mL細(xì)胞懸液,1 500 r/min離心5 min,使細(xì)胞沉淀,棄去上清液,細(xì)胞沉淀加1 mL pH 4.75的醋酸緩沖液混懸,反復(fù)凍融3～4次,3 000 r/min離心15 min，取上清液100 mL按照藥盒說明書進行測定。利用cAMP與125I-cAMP和特異性蛋白激酶競爭結(jié)合原理測定細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,GC-1200r放射免疫計數(shù)器上測定放射性強度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出細(xì)胞內(nèi)cAMP。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差“x±s”表示,方差齊者采用單因素方差分析方法,方差不齊者以秩和檢驗。細(xì)胞內(nèi)cAMP水平檢測見表1。

1.2.4 分組、給藥 取傳代7代以內(nèi)的細(xì)胞分為：空白對照組、馬錢苷組、芍藥苷組、丹皮酚組、腎上腺素+空白對照組、腎上腺素+馬錢苷組、腎上腺素+芍藥苷組、腎上腺素+丹皮酚組。其中馬錢苷組加入以增殖培養(yǎng)液配成的終濃度為10.0μg/mL的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，芍藥苷組加入以增殖培養(yǎng)液配成的終濃度為6.0μg/mL的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，丹皮酚組加入以增殖培養(yǎng)液配成的終濃度為16.0μg/mL的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。含腎上腺素組每組各加入0.01 mL（即每毫升10%培養(yǎng)液加0.01 mL腎上腺素）（終濃度=加入的血清體積/總體積×100%）

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的檢測 取第6代大鼠前脂肪細(xì)胞,以2×105個/mL的濃度傳于50 mL培養(yǎng)瓶中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)至生長旺盛時,棄培養(yǎng)液,給藥后分別培養(yǎng)48、72、96 h,收集細(xì)胞,用pH 4.75的醋酸緩沖液懸浮,調(diào)整濃度至106個/mL，取1 mL細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心 5 min，使細(xì)胞沉淀,棄去上清液,細(xì)胞沉淀加1 mL pH 4.75的醋酸緩沖液混懸,反復(fù)凍融 3～4次，3 000 r/min離心 15 min， 取上清液100μL按照藥盒說明書進行測定，利用cAMP與125I-cAMP和特異性蛋白激酶競爭結(jié)合原理測定細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,GC-1 200 r放射免疫計數(shù)器上測定放射性強度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出細(xì)胞內(nèi)cAMP。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分折

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸中3種入血成分對大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響

與空白組比較，馬錢苷有顯著性差異，其中以中劑量組的差異最為顯著。提示馬錢苷可使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平降低，且以中劑量組使其水平降低的較多。而芍藥苷和丹皮酚雖沒有顯著性差異，但兩者的中劑量組均使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平降低較多。六味地黃方3入血成分中劑量組均使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低較明顯，因此我們選用其中劑量作為最佳濃度來測定不同時間點腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，結(jié)果見表1。

表1 六味地黃丸3種入血成分對大鼠前脂肪細(xì)胞cAMP的影響

2.2 六味地黃丸3種入血成分對腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平不同時間點的影響

含腎上腺素空白組與不含腎上腺素空白組比較，在48、72、96 h 3個時間點均差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示腎上腺素空白血清可使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，且其對cAMP水平升高的促進作用隨時間的延長而降低；各單體入血成分不含腎上腺素組與不含腎上腺素空白對照組比較，馬錢苷組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示馬錢苷可使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低，且其對cAMP水平升高的促進作用隨時間的延長而無明顯的改變，表明馬錢苷能降低前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，且隨著時間的延長對細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平的影響無明顯的變化；各單體入血成分含腎上腺素組與不含腎上腺素空白對照組比較，在48、72、96 h 3個時間點馬錢苷差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示含腎上腺素的馬錢苷含藥血清對大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平無顯著的影響，且隨作用時間的延長而無明顯變化。綜上各實驗表明：腎上腺素空白血清可使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，馬錢苷是六味地黃方中降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的主要有效成分之一；由于馬錢苷是六味地黃方中降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的主要有效成分之一，因此在拮抗腎上腺素使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平升高的作用的有效成分中，馬錢苷起到一定的作用；通過在48、72、96 h 3個培養(yǎng)時間點的觀察，馬錢苷對細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的影響無明顯的差異，因此，在培養(yǎng)48 h后可達到最佳作用，結(jié)果見表2。

表2 六味地黃丸3種入血成分對大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的影響 （n=6）

3 討論

中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究目的在于以現(xiàn)代化學(xué)與藥理學(xué)為基礎(chǔ)，闡明復(fù)方的有效部位及有效成分，由于其所含成分的復(fù)雜性，導(dǎo)致中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究進展緩慢，從而使其作用機制、生物轉(zhuǎn)化和代謝過程等系列研究也就成了無的放矢；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確直接造成中藥不能建立與國際接軌的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，缺乏可靠的藥理學(xué)、毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)，儼然成為制約中藥發(fā)展的“瓶頸”[2]。目前，絕大多數(shù)中藥及復(fù)方仍然只能采用傳統(tǒng)的口服給藥的方式，口服中藥后的血清中含有真正的有效成分，即原形成分、代謝產(chǎn)物及機體產(chǎn)生的應(yīng)激性成分。因此，通過分析口服給藥后血清中成分，確定中藥及復(fù)方的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，將成為快速、準(zhǔn)確的研究確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有效途徑。1989年，日本學(xué)者田代真一提出了“血清藥化學(xué)”的概念[3]。血清藥物化學(xué)主要是研究血清中的化學(xué)物質(zhì)，觀測血清中外源性活性物質(zhì)及其作用和代謝規(guī)律。王喜軍等于1997年正式提出了“中藥血清藥物化學(xué)的概念及理論”，中藥血清藥物化學(xué)即是建立在中藥有效成分形成、吸收和分布規(guī)律上的一種中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的理論和方法，他們利用此方法進行了六味地黃丸的血清藥物化學(xué)研究，研究結(jié)果表明口服六味地黃丸后從血中發(fā)現(xiàn)了11個入血成分，其中4個為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物；7個成分為六味地黃丸體外所含成分的原型，其中有一成分雖為熟地中所含原型成分，但其他2種藥材也能代謝產(chǎn)生，對其體內(nèi)的量變有共同的貢獻[4]。本研究在此基礎(chǔ)上對六味地黃丸中的部分有效組分群進行了追蹤研究，確定了六味地黃丸含藥血清中的3個原型入血成分：馬錢苷、丹皮酚、芍藥苷，因此在實驗中我們選用以上3種成分來研究其對大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響。

芍藥苷為單萜苷類成分，馬錢苷為環(huán)烯醚萜苷類成分，丹皮酚為酚類成分，這幾種成分結(jié)構(gòu)有一定的差別，但都為六味地黃丸中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此通過本實驗了解這3種成分中有哪種或哪些成分能降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，從而進一步明確哪一類化合物可特異性結(jié)合細(xì)胞膜表面的受體，以揭示該化合物的作用機制。

六味地黃方（湯、丸、超微）含藥血清中含有3種入血成分：馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚，它們在陰虛病理狀態(tài)下血清中3種成分的含量比正常狀態(tài)下升高,且馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的含量都以超微最高，其次為丸劑、湯劑。本實驗所得的結(jié)果：六味地黃方3種入血成分中只有馬錢苷使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低，確認(rèn)馬錢苷為六味地黃方中降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的主要有效成分。因而提示六味地黃方在治療陰虛病癥時主要是通過馬錢苷對cAMP系統(tǒng)改變是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的環(huán)核苷酸系統(tǒng)而達到的。

早在上世紀(jì)50年代，Earl Sutherland首先發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腎上腺素結(jié)合到它的肝細(xì)胞表面受體時，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。同時，當(dāng)腎上腺素激動β受體，可促使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。本研究也進一步證實了該結(jié)論，同時也發(fā)現(xiàn)馬錢苷能拮抗腎上腺素使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平升高的作用。因此，通過本研究可以知道馬錢苷可能是通過特異性結(jié)合細(xì)胞表面β受體，進而對大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平產(chǎn)生影響。同時，本研究通過在不同時間點測定其細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，發(fā)現(xiàn)各個單體在3個時間點細(xì)胞內(nèi)cAMP水平均沒有明顯變化，實驗證明馬錢苷是降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的主要有效成分，故在給藥48 h后，藥物作用效果已達到最大，無需進一步觀察。

[1]張 寧，王喜軍.六味地黃丸血中移形成分的含量測定[J].中藥新藥與臨床藥理，2004，15（3）：174-176.

[2]王喜軍.中藥及中藥復(fù)方的血清藥物化學(xué)研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2002，4(2)：1.

[3]李 萍，劉惠如，黃 濤.中藥血清藥物化學(xué)對中藥現(xiàn)代化的意義[J]. 中國藥業(yè)，2007，l6（2）：58.

[4]王喜軍，張 寧.六味地黃丸的血清藥物化學(xué)研究[J].中國天然藥物，2004，2(4)，219-222.