動脈粥樣硬化兔模型的建立及評價

何新群，岳增輝，常小榮，符 凌，張 亮，商李超

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

動脈粥樣硬化(atherosc1erosis，AS)是指在動脈及其分支的動脈壁內(nèi)膜及內(nèi)膜下有脂質(zhì)沉著，同時伴有中層平滑肌細(xì)胞移行至內(nèi)膜下并增殖，導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，形成黃色或灰黃色狀如粥樣物質(zhì)的斑塊，最終引起動脈壁增厚、變硬、失去彈性，終致管腔狹窄[1]。該病無論在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家其發(fā)病率都呈上升趨勢，成為了嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病之一?；谶@一現(xiàn)狀，研究AS的發(fā)病機(jī)制、病理變化，以便早預(yù)防、早診斷、早治療有重要的現(xiàn)實意義，這就勢必要尋求一種快速、優(yōu)化的方法建立AS動物模型。近10年來，在基礎(chǔ)實驗和臨床方面對于動脈粥樣硬化的研究均有較大進(jìn)展，本文所采用的造模方法是在綜合其他AS造模方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行改良設(shè)計，安全、無創(chuàng)傷，模型能夠成功建立，為今后研究動脈粥樣硬化提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 新西蘭大耳白兔30只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，3月齡，由東創(chuàng)實驗動物中心提供（合格證號：醫(yī)動檢證字2006-0001），普通飼料由湖南東創(chuàng)實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 牛血清蛋白（sigma公司）；卵清白蛋白（羅氏公司）；膽固醇（sigma公司）；蛋黃粉（安徽亳州市眾意蛋業(yè)有限責(zé)任公司）；豬油（湖北宜昌雙匯食用油有限責(zé)任公司）；血脂試劑盒（羅氏公司），其余試劑均系進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 TGL16M臺式高速冷凍離心機(jī)（長沙科威實業(yè)有限公司）；全自動生化分析儀Roche Hitachi917型（日本日立公司）；瑞典產(chǎn)LKB-Ш型超薄切片機(jī)；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡 (德國LEICA公司)等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將兔單籠飼養(yǎng)，飼喂正常的普通飼料觀察1周后進(jìn)入實驗。隨機(jī)將30只兔分為2組，每組15只，模型組喂高脂飼料；對照組喂普通飼料，自由飲水，每只兔進(jìn)食量按30 g/（kg·d）給予，并根據(jù)體質(zhì)量增減不斷調(diào)整進(jìn)食量，喂養(yǎng)10周，稱體質(zhì)量1次/周并記錄。實驗過程中，共死亡10只，其中空白組3只、模型組2只因腹瀉致死；模型組2只在注射牛血清蛋白時急性死亡；空白組2只、模型組1只不明原因死亡。

1.2.2 模型制備 采用高脂飼料（15%蛋黃粉、5%豬油[2]、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、77.5%普通飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心加工成顆粒飼料）喂養(yǎng)，并于第1天、第3天、第5天從兔耳緣靜脈注射牛血清白蛋白125 mg/kg，總共3次，同時用卵清白蛋白進(jìn)行皮下注射[3]，2.5 mg/kg，2 d/次，共5次，喂養(yǎng) 10周。

1.2.3 病理標(biāo)本收集與處理 喂養(yǎng)10周后，經(jīng)兔耳緣靜脈注入4%烏拉坦4 mL/kg，麻醉后取頸動脈血離心后取血清進(jìn)行血脂檢測，解剖實驗動物暴露胸主動脈，截取完整的升主動脈、主動脈弓和胸主動脈剝離干凈用于拍照和檢測。取下主動脈弓約1.5 cm，用生理鹽水稍沖洗后以4%多聚甲醛保存，HE（蘇伊紅）染色，光鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用“”表示，方差分析比較總體差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況的觀察

部分兔因用籠具喂養(yǎng)時間長發(fā)生足癬，定期消毒籠具并用10 g／L克霉唑液進(jìn)行局部噴灑；腹瀉兔用諾氟沙星灌服后，可得以控制。

2.2 造模前后體質(zhì)量的影響

空白組、模型組兩組兔的體質(zhì)量造模10周后較造模前均增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 造模前后兔體質(zhì)量的變化情況

表1 造模前后兔體質(zhì)量的變化情況

組 別空白組模型組n 10 10造模前2.13±0.12 2.26±0.05造模后2.80±0.24 2.88±0.17

2.3 對兔血脂的影響

飼喂高脂飼料10周的家兔采血離心后肉眼即可見為高脂肪血且有乳糜，空白組血液離心后上清液清亮。檢測結(jié)果模型組膽固醇明顯增高，比空白對照高出10～15倍，甘油三酯升高不明顯，高密度脂蛋白有的升高有的下降。空白組與模型組的血脂各項指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組比較，模型組的 TC、TG、LDL 含量明顯升高（P＜0.01），HDL/LDL 值明顯降低（P＜0.01）。 結(jié)果見表2。

表2 造模后兩組兔的血脂情況 （n=10，，mmol/L）

表2 造模后兩組兔的血脂情況 （n=10，，mmol/L）

注：與空白組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別空白組TC 3.35±0.37 40.34±1.28▲▲TG 0.84±0.11 4.70±0.92▲▲HDL 3.22±0.14 4.63±0.43▲LDL 1.10±0.61 110.54±0.03▲▲HDL/LDL 2.83±0.46 1 0.44±0.13▲▲

2.4 對兔病理形態(tài)學(xué)觀察

2.4.1 肉眼觀察 兩組主動脈內(nèi)膜對比觀察（圖1）：空白組兔主動脈形態(tài)正常，柔軟而有彈性，管腔內(nèi)膜光滑且較薄，未見脂質(zhì)沉積及斑塊形成。模型組家兔動脈彈性差，主動脈內(nèi)膜有明顯大小不等的突起于內(nèi)膜表面的黃白色脂質(zhì)條紋及隆起脂質(zhì)斑塊形成，邊緣不整齊，部分區(qū)域連延成片；解剖可見肝臟為明顯的脂肪肝改變。

2.4.2 HE染色光鏡觀察 圖2所示：空白組主動脈內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞緊貼內(nèi)彈力板，排列有序，內(nèi)膜無泡沫細(xì)胞、淋巴細(xì)胞聚集；中層平滑肌細(xì)胞排列整齊呈長型或橢圓型，無增生現(xiàn)象，彈力纖維無斷裂及溶解現(xiàn)象；胞漿、嗜酸紅染，無脂質(zhì)沉積。圖3所示：模型組主動脈內(nèi)膜顯著增厚，有多發(fā)性不規(guī)則的紅色隆起，脂質(zhì)斑塊部位有的表面內(nèi)皮細(xì)胞脫失，內(nèi)膜下可見大量泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集，呈圓形或長形，脂質(zhì)核心可見壞死現(xiàn)象，中膜平滑肌增生，彈力纖維斷裂、溶解，斑塊凸向管腔，呈典型的脆性斑塊表現(xiàn)。

圖1 主動脈內(nèi)膜直觀圖

圖2 空白組主動脈內(nèi)膜光鏡圖（×400）

圖3 模型組主動脈內(nèi)膜光鏡圖（×400）

3 討論

血脂檢測是評價AS病變的一個公認(rèn)、必不可少的指標(biāo)。高脂血水平是AS動物模型成功建立的評判依據(jù)之一。高脂血癥與AS的關(guān)系已經(jīng)得到證實，血漿膽固醇水平與AS的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。血漿膽固醇主要以LDL的形式存在，能在血漿內(nèi)或動脈內(nèi)膜下經(jīng)自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化轉(zhuǎn)變成氧化修飾的LDL（ox-LDL），它在AS發(fā)生、發(fā)展及斑塊形成過程中有至關(guān)重要的作用。HDL具有抗炎抗氧化，能促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)錄，有抗AS作用。LDL的升高和HDL的降低是AS形成的重要表現(xiàn)。病理學(xué)檢測是評價AS造模成功的重要指標(biāo)。兔是AS最常用的造模動物，因其對喂飼膽固醇非常敏感，吸收率高達(dá)75%～90%，且對高血脂清除能力低，在短期內(nèi)即可誘發(fā)明顯病變[4]。本文通過高脂飼養(yǎng)與免疫損傷相結(jié)合的方法，在較短時期內(nèi)成功復(fù)制出穩(wěn)定可靠的動脈粥樣硬化兔模型。其動脈局部病理特點與人類動脈粥樣硬化病理特點已非常相似，如中膜平滑基層變薄、內(nèi)膜增厚、巨噬細(xì)胞的侵入和內(nèi)彈力層破壞等，能滿足實驗研究的需要。

由于家兔體質(zhì)及進(jìn)食等都存在個體差異性，模型組中各兔AS病變程度有差異。根據(jù)肉眼大體觀察動脈管壁進(jìn)行病變硬化分級[5]方法進(jìn)行評價，模型組中有3只家兔動脈病變評定為1級，2只兔動脈病變評定為4級，其余病變硬化程度評定為3級。這種病變程度的不均衡性勢必會影響療效的評定，上述現(xiàn)象提示我們對于把握動脈粥樣硬化形成程度方面存在缺陷，有待進(jìn)一步的深入探索研究。

試驗中我們還發(fā)現(xiàn)在模型組高脂飼料喂養(yǎng)過程中，部分兔出現(xiàn)食欲下降，可補(bǔ)充給予少量青草、菜葉以改善食欲，發(fā)生腹瀉應(yīng)及早使用抗感染藥物對癥處理；飼養(yǎng)時間較長易出現(xiàn)足癬現(xiàn)象，應(yīng)該加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生，定期對籠具進(jìn)行清洗、消毒，這樣才能避免在實驗過程中出現(xiàn)意外死亡。在常用的實驗中，草食性動物兔不容易自發(fā)產(chǎn)生動脈粥樣硬化斑塊，但它對高脂飲食特別敏感，有報道稱過量的高脂飲食產(chǎn)生的病變類似于似黃瘤病[6]。即動脈內(nèi)膜的廣泛增生并纖維化，而不像人類的動脈粥樣硬化斑塊，在實驗中若高脂飲食的喂養(yǎng)過于集中、沒有經(jīng)過加工等，可導(dǎo)致一些過量的高脂飲食動物的斑塊類似黃瘤病，而另一些高脂飲食攝入不足的動物動脈粥樣斑塊僅僅停留在脂紋期。故在實驗中使膽固醇充分與基礎(chǔ)飼料混合再加工成顆粒狀，并且控制每日的攝入量，也是實驗成功的保障。牛血清蛋白誘發(fā)免疫反應(yīng)導(dǎo)致動脈壁的損傷和動脈粥樣硬化形成已經(jīng)有報道[7]。但應(yīng)注意把握好注射的劑量和速度，防止因劑量過大、注射過快導(dǎo)致的死亡事件。

[1]張美玲，王茁伉.動脈粥樣硬化動物模型研究進(jìn)展[J].四川動物，2009，28（5）：794-797.

[2]魏國華，劉 蘭.高脂飲食所致動脈粥樣硬化家兔肝組織學(xué)損傷評估[J].中國動脈硬化雜志，2008，16（5）：373-375.

[3]王園園，龍民慧，周磊磊，等.兔動脈粥樣硬化模型的建立和評價[J].實驗動物學(xué)，2008,25（3）：18-21.

[4]張均田.現(xiàn)代藥理實驗方法[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998：261.

[5]朱 榆，多秀瀛.實驗動物的疾病模型[M].天津科技翻譯公司，1997：167.

[6]言偉強(qiáng)，土成林，劉遠(yuǎn)健，等.肝血管瘤的螺旋CT三期掃描分析[J].中國 CT 和 MRI雜志，2004,2（3）：34-37.

[7]李儀圭.中藥藥理實驗方法學(xué)[M].上海：上?？萍汲霭嫔纾?006：426.