產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌中整合子的研究

陸思靜，管希周，王睿，梁志欣，劉又寧（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科，錦州市 11001；.解放軍總醫(yī)院軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，北京市 100853）

產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌中整合子的研究

陸思靜1＊，管希周2，王睿2，梁志欣2，劉又寧2（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科，錦州市 121001；2.解放軍總醫(yī)院軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，北京市 100853）

目的：觀察25株產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌中整合子的分類(lèi)、結(jié)構(gòu)及其在介導(dǎo)AmpC酶基因轉(zhuǎn)移中的作用。方法：采用微量稀釋法測(cè)定20種抗生素對(duì)試驗(yàn)菌株的敏感性。利用多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法檢測(cè)整合酶基因（intI）及其定位，對(duì)其陽(yáng)性菌株可變區(qū)（Int）擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果：這25株菌對(duì)多種抗生素耐藥。20株Ⅰ類(lèi)整合酶基因陽(yáng)性（80%）；所攜帶的耐藥基因盒絕大多數(shù)為aadA5和dfr 17；未發(fā)現(xiàn)攜帶AmpC基因盒的整合子。結(jié)論：Ⅰ類(lèi)整合子廣泛地存在于產(chǎn)AmpC酶的大腸桿菌中；耐藥基因盒是整合子陽(yáng)性菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物及氯霉素耐藥的主要原因，但對(duì)介導(dǎo)AmpC酶基因轉(zhuǎn)移，不起主要作用。

整合子；產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌；基因盒；聚合酶鏈反應(yīng)

大腸桿菌是引起臨床感染最常見(jiàn)的細(xì)菌之一，隨著多重耐藥菌株的日漸增多，治療該菌引起的感染變得越來(lái)越困難。其耐藥機(jī)制非常復(fù)雜。研究表明，整合子因其不僅可介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性群聚，導(dǎo)致多重耐藥性的產(chǎn)生，而且可以在不同遺傳物質(zhì)和菌種間轉(zhuǎn)移，引起耐藥基因高效快速轉(zhuǎn)移而已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[1]。但國(guó)內(nèi)這方面的研究鮮見(jiàn)。整合子由5′和3′保守末端及中間的可變序列組成，5′保守末端攜帶編碼整合酶的基因（intI）、整合酶基因重組位點(diǎn)（attI）和一個(gè)啟動(dòng)子的基因片段。中間的可變區(qū)域攜帶有耐藥基因的基因盒[2]?，F(xiàn)已確認(rèn)至少有9種整合子，但在耐藥方面起最主要作用的為第1類(lèi)整合子[3]。以解放軍總醫(yī)院臨床連續(xù)收集的25株產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌為對(duì)象，對(duì)整合子分布及其結(jié)構(gòu)特征、整合子在介導(dǎo)耐藥轉(zhuǎn)移中的作用進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源

解放軍總醫(yī)院微生物科從2001～2002年各種臨床標(biāo)本中分離得到的全部大腸桿菌719株。用三維試驗(yàn)、等電聚焦電泳等方法進(jìn)一步篩選高產(chǎn)AmpC酶的菌株25株[4]。

1.2 主要試劑與儀器

DL 15 000 DNA Marker為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；pGEMT載體、DNA聚合酶采用美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；包被20種抗生素的96孔藥敏板（天津金章醫(yī)用新技術(shù)研究所）；DNA Thermal Cycler 2400為美國(guó)Perkin Elmer公司產(chǎn)品。

1.3 藥敏試驗(yàn)方法

采用微量稀釋法測(cè)定產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌對(duì)以下20種抗生素的最低抑菌濃度（MIC）：磺胺甲基異唑、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、氯霉素、四環(huán)素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922。藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）2004[5]年版的規(guī)定執(zhí)行。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)將中敏歸于耐藥分析。

1.4 整合酶基因的PCR檢測(cè)

引物序列為IntIF：5′-TGC GGG TYA ARG ATB TKG ATT-3′，IntIB：5′-CAR CAC ATG CGT RTA RAT-3′（其中，Y代表C或T；R代表A或G；B代表C，G或T；K代表G或T），目的片段長(zhǎng)度491 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，然后進(jìn)入循環(huán)94℃1 min，51℃30 s，72℃45 s，循環(huán)40次，最后72℃延伸10 min，在紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳中的分析結(jié)果，出現(xiàn)明顯亮帶的為初篩陽(yáng)性。陽(yáng)性條帶行切膠純化后測(cè)序，用Blast程序分析。

1.5 可變區(qū)基因盒PCR檢測(cè)及DNA測(cè)序分析

引物序列為Int-F：CGG ATG AAG GCA GCAACC CA，Int-R：AAG CAG ACT TGA CCT GAT AG。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)72℃延伸7 min，4℃保護(hù)。在紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳中的分析結(jié)果，陽(yáng)性條帶行切膠純化，TA克隆，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司及上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。在Genbank比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌中整合酶基因PCR檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果

20株產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌均在500 bp左右出現(xiàn)了陽(yáng)性條帶，提示上述菌株攜帶了整合酶基因，陽(yáng)性率為20/25（80%），結(jié)果見(jiàn)圖1。隨機(jī)抽取的2個(gè)樣品ECO03、ECO34測(cè)序，結(jié)果在Genbank上Blast為Ⅰ類(lèi)整合酶。與AY463797比較序列符合率（identities）為100%。

2.2 Ⅰ類(lèi)整合子可變區(qū)相關(guān)基因盒擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)20株Ⅰ類(lèi)整合陽(yáng)性菌株用可變區(qū)基因盒特異引物，擴(kuò)增出的20個(gè)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，根據(jù)片段大小分成3組：16株出現(xiàn)接近1 700 bp大小條帶的為A組；1株出現(xiàn)接近2 000 bp大小條帶的為B組；3株出現(xiàn)大于2 500 bp條帶為C組。整合子可變區(qū)特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。在A組中隨機(jī)抽取4株，B組1株、C組3株分別進(jìn)行測(cè)序和序列分析。A組片段大小為1 664 bp，其含有2個(gè)開(kāi)放閱讀框，大小分別為474 bp和789 bp，與耐藥基因盒aadA5和dfr17都為100%同源，分別對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類(lèi)藥物甲氧芐啶產(chǎn)生耐藥，這4株所帶基因盒完全一致，Genbank登陸號(hào)分別為AY748452和AY828551。B組PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，其長(zhǎng)度為1 913 bp，內(nèi)部插入dhfrⅫ基因（編碼二氫葉酸還原酶，對(duì)磺胺類(lèi)耐藥）和aadA2基因（編碼氨基酰腺苷?；D(zhuǎn)移酶，對(duì)氨基糖苷類(lèi)耐藥），序列符合率100%，還有一編碼功能不清楚的ORF5，Genbank登陸號(hào)AY748453。C組PCR產(chǎn)物經(jīng)多次測(cè)序失敗，仍在研究中。

圖1 整合酶基因PCR結(jié)果電泳圖M.2 000 bp DNAMarker；1～7均為試驗(yàn)菌株Fig 1 Electrophoretogram of PCR product of intIM.2 000 bp DNAMarker；1～7.test strains

圖2 整合子可變區(qū)特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖M.15 000 bp DNAMarker；1～2為A組；3為B組；4～5為C組Fig 2 Electrophoretogram for PCR product of specific primer in variable regions of integronsM.15 000 bp DNAMarker；1～2.groupA；3.group B；4～5.group C

2.3 20種抗生素對(duì)25株產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌的體外抗菌活性

本研究的25株大腸埃希菌對(duì)20種抗生素的敏感率由高到低的順序依次為碳青霉烯類(lèi)中的亞胺培南100%；氨基糖苷類(lèi)中的奈替米星91%、阿米卡星87%、卡那霉素74%、妥布霉素70%，而頭孢類(lèi)僅頭孢吡肟65%，其余均在50%或以下，結(jié)果見(jiàn)表1（表中S、I、R分別代表細(xì)菌敏感率、中介率和耐藥率，其中，R＝耐藥菌株數(shù)/受試菌總株數(shù)，I、R的計(jì)算方法類(lèi)同）。

由表1可見(jiàn)，大腸埃希菌對(duì)左氧氟沙星、頭孢西丁的耐藥率高達(dá)100%，環(huán)丙沙星95%、、四環(huán)素91%、替卡西林86%，磺胺甲基異唑、加替沙星、替卡西林/克拉維酸耐藥率均達(dá)80%。

3 討論

試驗(yàn)顯示，25株產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌中整合子檢出率為80%，均為Ⅰ類(lèi)整合子，高于其他國(guó)家或地區(qū)的平均水平43%～76%左右[6]，可能因?yàn)椋海?）實(shí)驗(yàn)樣本均為分離自患者的藥敏測(cè)試中具有多重耐藥表型的高耐藥菌；（2）由于有的第Ⅰ類(lèi)整合子具有不完整的3′-保守端，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)上，應(yīng)用了簡(jiǎn)并引物，可同時(shí)檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合子的分布，防止以3′-保守端擴(kuò)增結(jié)果作為整合子陽(yáng)性菌株的檢出方法所造成漏檢。

表1 大腸埃希菌對(duì)20種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of susceptibility test of 20 kinds of antibiotics to Escherichia coli

研究表明，整合子所攜帶與耐藥基因盒主要是aadA5和dfr17，aadA2和dhfrXII基因，未檢測(cè)到AmpC酶基因和介導(dǎo)喹諾酮類(lèi)耐藥的基因。盡管有大量報(bào)道β-內(nèi)酰胺類(lèi)基因盒是整合子最常攜帶的基因盒之一，但本研究的25株產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌在前期試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)攜帶產(chǎn)AmpC酶基因[4]，至少有17株細(xì)菌整合子未攜帶產(chǎn)AmpC酶耐藥基因盒，與報(bào)道不一致[7，8]。提示，在本研究的25株大腸桿菌中，耐藥基因盒在介導(dǎo)產(chǎn)AmpC酶耐藥轉(zhuǎn)移方面，不起主要作用。

盡管這25株大腸埃希菌對(duì)包括喹諾酮類(lèi)、青霉素類(lèi)及酶抑制劑合劑、四環(huán)素、第3代頭孢菌素及酶抑制劑合劑、磺胺甲基異唑、慶大霉素等十余種抗生素耐藥，但對(duì)碳青霉烯類(lèi)中的亞胺培南，敏感率仍高達(dá)100%，與有些報(bào)道[9]一致；對(duì)氨基糖苷類(lèi)的阿米卡星和奈替米星仍然保持了較高的敏感率。對(duì)高產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌引起的感染，除碳青霉烯類(lèi)外，氨基糖苷類(lèi)抗生素是可以選擇的對(duì)象，但對(duì)治療整合子陽(yáng)性的耐藥菌株，部分氨基糖苷類(lèi)抗生素則無(wú)效。

值得注意的是，Verdet等[10]首次報(bào)道AmpC酶DHA-1編碼基因定位于3′-保守末端整合子，此后盡管報(bào)道很少，也應(yīng)引起足夠重視。細(xì)菌自身染色體上的整合子-耐藥基因盒可通過(guò)復(fù)制傳遞給下一代，即垂直傳播；而整合在質(zhì)粒上的則可在同菌屬甚至不同菌屬間水平傳播。

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Study on Integron of AmpC Enzyme-producing Escherichia Coli

LU Si-jing（Dept.of Respiratory，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）
GUAN Xi-zhou，WANG Rui，LIANG Zhi-xin，LIU You-ning（Chinese PLA Postgraduate Medical School，Beijing 100853，China）

OBJECTIVE：To investigate the classification，structure and integron-mediated AmpC enzyme gene transfer of integron in 25 strains of AmpC enzyme-producing Escherichia coli.METHODS：Sensitivity of test strains to 20 kinds of antibiotics was tested by microdilution method.PCR and sequencing were performed on test strains to identify integrase gene（intI）and its location，the product of variable region of positive integrons（Int）respectively.RESULTS：ClassⅠintI were indentified in 20 strains（80%）of 25 strains Escherichia coli.The most drug resistance box cassettes were aadA5 and dfr17 and integory encoding AmpC gene cassette was not observed.CONCLUSION：ClassⅠintegron resided in AmpC enzyme-producing Escherichia coli widely. The cause of drug resistance of integorn to aminoglycosides，sulfonamides，chloramphenicol is drug resistance gene cassette.Gene cassette does not play important role in integron-mediated antibiotic resistant gene transformation.

Integron；AmpC enzyme-producing Escherichia coli；Gene cassettes；PCR

R378.2+1；R969.3

A

1001-0408（2010）14-1293-03

2009-12-06

2010-01-24）